本文關(guān)鍵詞：三種小兒常見病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 呼吸道合胞病毒 腺病毒 輪狀病毒 熒光定量PCR 復(fù)合探針

【摘要】：小兒呼吸道感染、腸道感染是小兒感染性疾病中最為常見的兩種疾病。這兩類疾病中80%以上為病毒感染。在病毒感染性疾病中,呼吸道合胞病毒和C組腺病毒是嬰幼兒時(shí)期呼吸道病毒感染最常見的病原體,可引起嚴(yán)重的毛細(xì)支氣管炎和肺炎；而F組腺病毒和輪狀病毒作為引起嬰幼兒腹瀉的最常見病原在世界各地均有散發(fā)和流行,因此對(duì)主要病原體進(jìn)行監(jiān)測(cè)和檢測(cè),在防控小兒傳染病中具有重要的意義。 自從1996年美國(guó)Applied Biosystems公司率先推出實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以來,該技術(shù)迅速被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和病原體檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以對(duì)初始模板定量,具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快捷、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等其他技術(shù)無法替代的優(yōu)點(diǎn)已成為了核酸檢測(cè)的重要工具：而復(fù)合探針技術(shù)是在熒光定量PCR基礎(chǔ)上開發(fā)的新技術(shù),除具備實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的全部?jī)?yōu)點(diǎn)外,還具有高效,快速,背景干擾小且成本低等優(yōu)點(diǎn),為病原微生物檢測(cè)提供一種更為可靠有效的檢測(cè)方法。本文以實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ),旨在對(duì)呼吸道合胞病毒、腺病毒及輪狀病毒分別建立一種高效靈敏的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確診斷,為進(jìn)一步擴(kuò)大小兒傳染性疾病的監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)研究提供可靠有效的方法。 依據(jù)TaqMan探針、復(fù)合探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物探針設(shè)計(jì)原則,分別設(shè)計(jì)特異性的引物和探針,通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)篩選出最佳引物探針組合：對(duì)PCR擴(kuò)增體系中熱啟動(dòng)Taq酶用量、逆轉(zhuǎn)錄酶用量、逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)時(shí)間、PCR退火溫度等反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,建立最佳的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法；并對(duì)‘所建立的熒光定量PCR方法的靈敏性、特異性及精密性進(jìn)行評(píng)價(jià)；同時(shí)將所建立的方法用于臨床發(fā)熱、肺炎和腹瀉嬰幼兒患者的痰液、糞便標(biāo)本檢測(cè),對(duì)本方法的檢測(cè)效果進(jìn)行評(píng)估。 經(jīng)優(yōu)化,確立了呼吸道合胞病毒、腺病毒、輪狀病毒最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件；呼吸道合胞病毒的檢測(cè)靈敏度RSV A型最低可達(dá)2.0×102copies/mL、RSV B型最低可達(dá)5.0×102copies/mL;與非呼吸道合胞病毒等常見呼吸道病毒均無交義反應(yīng)；批間批內(nèi)變異系數(shù)均小于5%：對(duì)呼吸首合胞病毒感染患者咽拭子標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果表明：該方法與臨床診斷結(jié)果的符合牢為99.23%。腺病毒的檢測(cè)靈敏度ADV2型最低可達(dá)2.0×101PFU/ml、ADV40型最低可達(dá)5.0×101PFU/ml;與非腺病毒等常見呼吸道病毒、腸道炳毒均無交義反應(yīng)；批間批內(nèi)變異系數(shù)均小于5%；對(duì)腺病毒感染患者咽拭子、糞便標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果表明：該方法與臨床診斷結(jié)果的符合率分別為99.14%、99.09%。輪狀病毒的檢測(cè)靈敏度RV SA-11標(biāo)準(zhǔn)株最低可達(dá)5.0×101PFU/ml;與非輪狀病毒等常見腸道病毒均無交文反應(yīng)：批間批內(nèi)變異系數(shù)均小于5%；對(duì)來自王家醫(yī)院輪狀病毒感染患者糞便標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果表明：該方法與臨床診斷結(jié)果的符合率分別為98.63%、99.17%和99.14%。 本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法能夠快速準(zhǔn)確、特異、高靈敏度的對(duì)三種小兒常見病毒核酸進(jìn)行定性檢測(cè),為臨床提供新的更為可靠的檢測(cè)方法。
【關(guān)鍵詞】：呼吸道合胞病毒 腺病毒 輪狀病毒 熒光定量PCR 復(fù)合探針
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R725.1;R440
【目錄】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 第一章 前言13-30
• 1.1 呼吸道合胞病毒13-16
• 1.1.1 生物學(xué)性狀13-14
• 1.1.2 流行病學(xué)14-15
• 1.1.3 臨床表現(xiàn)15-16
• 1.1.4 臨床診斷16
• 1.2 腺病毒16-21
• 1.2.1 生物學(xué)性狀16-18
• 1.2.2 流行病學(xué)18-19
• 1.2.3 臨床表現(xiàn)19-20
• 1.2.4 臨床診斷20-21
• 1.3 輪狀病毒21-24
• 1.3.1 生物學(xué)性狀21-22
• 1.3.2 流行病學(xué)22
• 1.3.3 臨床表現(xiàn)22-23
• 1.3.4 臨床診斷23-24
• 1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR24-28
• 1.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR24-25
• 1.4.2 TaqMan探針熒光定量PCR25-26
• 1.4.3 復(fù)合探針熒光定量PCR26-28
• 1.5 本試驗(yàn)的立題依據(jù)和基本思路28-30
• 1.5.1 立題依據(jù)28
• 1.5.2 基本思路28-30
• 第二章 呼吸道合胞病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用30-45
• 2.1 引言30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與實(shí)驗(yàn)儀器30-31
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法與步驟31-33
• 2.3.1 引物探針31
• 2.3.2 RSV病毒RNA的提取31-32
• 2.3.3 TaqMan探針與復(fù)合探針檢測(cè)結(jié)果比較32
• 2.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立32
• 2.3.5 線性關(guān)系檢測(cè)32
• 2.3.6 靈敏度實(shí)驗(yàn)32-33
• 2.3.7 特異性實(shí)驗(yàn)33
• 2.3.8 精密性實(shí)驗(yàn)33
• 2.3.9 臨床標(biāo)本檢測(cè)33
• 2.4 結(jié)果33-44
• 2.4.1 引物與探針33-36
• 2.4.2 TaqMan探針與復(fù)合探針檢測(cè)結(jié)果比較36-37
• 2.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)37-38
• 2.4.4 線性關(guān)系分析38
• 2.4.5 靈敏度分析38-40
• 2.4.6 特異性分析40-41
• 2.4.7 精密性分析41-43
• 2.4.8 臨床標(biāo)本的檢測(cè)分析43-44
• 2.5 討論44-45
• 第三章 腺病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用45-61
• 3.1 引言45
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與實(shí)驗(yàn)儀器45-46
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法與步驟46-49
• 3.3.1 引物探針46-47
• 3.3.2 ADV病毒DNA的提取47
• 3.3.3 TaqMan探針與復(fù)合探針檢測(cè)結(jié)果比較47
• 3.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立47-48
• 3.3.5 線性關(guān)系檢測(cè)48
• 3.3.6 靈敏度實(shí)驗(yàn)48
• 3.3.7 特異性實(shí)驗(yàn)48-49
• 3.3.8 精密性實(shí)驗(yàn)49
• 3.3.9 臨床標(biāo)本檢測(cè)49
• 3.4 結(jié)果49-60
• 3.4.1 引物與探針49-52
• 3.4.2 TaqMan探針與復(fù)合探針檢測(cè)結(jié)果比較52-53
• 3.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)53-54
• 3.4.4 線性關(guān)系分析54
• 3.4.5 靈敏度分析54-56
• 3.4.6 特異性分析56-57
• 3.4.7 精密性分析57-59
• 3.4.8 臨床標(biāo)本的檢測(cè)分析59-60
• 3.5 討論60-61
• 第四章 輪狀病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用61-78
• 4.1 引言61
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與實(shí)驗(yàn)儀器61-62
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法與步驟62-65
• 4.3.1 引物探針62-63
• 4.3.2 RV病毒RNA的提取63
• 4.3.3 TaqMan探針與復(fù)合探針檢測(cè)結(jié)果比較63
• 4.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)63-64
• 4.3.5 線性關(guān)系檢測(cè)64
• 4.3.6 靈敏度實(shí)驗(yàn)64
• 4.3.7 特異性實(shí)驗(yàn)64
• 4.3.8 精密性實(shí)驗(yàn)64-65
• 4.3.9 臨床標(biāo)本檢測(cè)65
• 4.4 結(jié)果65-77
• 4.4.1 引物與探針65-70
• 4.4.2 TaqMan探針與復(fù)合探針檢測(cè)結(jié)果比較70-71
• 4.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)71
• 4.4.4 線性關(guān)系分析71-72
• 4.4.5 靈敏度分析72-73
• 4.4.6 特異性分析73
• 4.4.7 精密性分析73-75
• 4.4.8 臨床標(biāo)本的檢測(cè)分析75-77
• 4.5 討論77-78
• 第五章 總結(jié)與展望78-79
• 附錄1 本文所使用的儀器79-80
• 附錄2：TIANamp Virus RNA Kit病毒RNA提取試劑盒說明書80-81
• 附錄3：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖81-82
• 附錄4：RSV引物探針同源性分析82-86
• 附錄5：ADV引物探針同源性分析86-92
• 附錄6：RV-1引物探針同源性分析92-99
• 附錄7：RV-2引物探針同源性分析99-106
• 參考文獻(xiàn)106-116
• 致謝116-117
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表117

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 張其威,游上游,孫繼民,吳旗,余春華,張楚瑜;呼吸道合胞病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年07期

2 王梅;小兒急性呼吸道感染的病原學(xué)研究[J];中國(guó)兒童保健雜志;2003年02期

3 劉崇海;楊錫強(qiáng);魏鈺書;;呼吸道合胞病毒病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J];國(guó)際兒科學(xué)雜志;2006年01期

4 袁亞男;劉文忠;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的類型、特點(diǎn)與應(yīng)用[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2008年03期

5 陳蘇紅,王小紅,張敏麗,王升啟;復(fù)合探針熒光定量PCR方法的建立[J];生物技術(shù)通訊;2003年02期

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本文編號(hào)：1055345