本文關(guān)鍵詞：環(huán)境內(nèi)分泌干擾物引致性腺發(fā)育不良疾病模型的建立及中藥治療的作用機制研究

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【摘要】：目的：(1)建立環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disruptors, EEDs)引致性腺發(fā)育不良的雄性SD大鼠疾病模型。(2)制定針對EEDs的中藥治療方案,在性腺發(fā)育不良疾病模型上驗證該方案對EEDs抗雄激素作用及生殖毒性的拮抗作用,以模擬人類的疾病過程及藥物的治療作用。(3)采用分子生物學(xué)實驗方法,研究并闡明EEDs抗雄激素作用的機制及中藥拮抗EEDs抗雄激素作用的機制,為開發(fā)有效拮抗EEDs生殖毒性的中藥制劑提供理論依據(jù)。 方法：(1)預(yù)實驗：以青春前期(21日齡)雄性SD大鼠為實驗對象,選取具有代表性的EEDs——鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-2-ethylhexylphthalate, DEHP)及氯氰菊酯(Cypermethrin,CYP)作為染毒物質(zhì),建立SD雄性大鼠性腺發(fā)育不良的疾病模型。SD大鼠隨機分為5組,分別設(shè)置高、中兩個染毒劑量組,(DEHP750mg/kg高劑量組和DEHP500mg/kg中劑量組,CYP100mg/kg高劑量組和CYP80mg/kg中劑量組)及對照組(喂飼玉米油)。每日空腹給藥。以肛門生殖器間距、睪丸下降、包皮分離及外生殖器的發(fā)育狀況、睪丸濕重、睪丸系數(shù)、血清睪酮水平及睪丸病理組織改變?yōu)橹笜�。實驗�?shù)據(jù)采用單因素方差分析,觀察EEDs的抗雄激素作用。確定雄性SD大鼠性腺發(fā)育不良疾病模型建立的最佳染毒劑量及最佳染毒時間。(2)以青春前期(21日齡)雄性SD大鼠為實驗對象,以最佳劑量的DEHP及CYP建立單獨及聯(lián)合染毒的性腺發(fā)育不良疾病模型。24只雄性SD大鼠隨機分為對照組(喂飼玉米油)、DEHP染毒組(DEHP500mg/kg)、 CYP染毒組(CYP80mg/kg)和DEHP、CYP聯(lián)合染毒組(DEHP500mg/kg+CYP80mg/kg),每組6只。每日空腹給藥,連續(xù)染毒4周。以睪丸下降時間、包皮分離時間、肛門生殖器間距、血清睪酮水平、睪丸濕重、睪丸系數(shù)、睪丸病理組織學(xué)改變、睪丸超微結(jié)構(gòu)病變及睪丸標志酶活性為指標。實驗數(shù)據(jù)采用2×2析因方差分析,驗證EEDs的抗雄激素作用及其生殖毒性。(3)在先前的性腺發(fā)育不良疾病模型基礎(chǔ)上進一步建立中藥治療模型。70只雄性SD大鼠隨機分為對照組(喂飼玉米油)、染毒A組(DEHP500mg/kg)、染毒B組(CYP80mg/kg)和染毒C組(DEHP500mg/kg+CYP80mg/kg),治療組同時喂飼中藥,進行治療干預(yù)。每日空腹給藥,連續(xù)染毒4周。以睪丸下降時間、包皮分離時間、血清睪酮水平、睪丸濕重、睪丸系數(shù)、睪丸病理組織學(xué)改變、睪丸超微結(jié)構(gòu)病變?yōu)橹笜�。實驗�?shù)據(jù)采用單因素方差分析,驗證中藥對EEDs抗雄激素作用及其生殖毒性的拮抗作用。(4)采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction, FQ-PCR)及免疫印跡方法(Western Blot),檢測類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)、膽固醇側(cè)鏈裂解酶(cytochrome P450,family11,subfamily A,polypeptide1,CYP11A1)、17α羥化酶/17,20裂鏈酶(17α-hydroxylase/17,20-Iyase,CYP17A1)、3β-羥脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)、17β-羥脫氫酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase,17β-HSD)、雄激素受體(androgen receptor,AR)的基因及蛋白表達水平。實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。通過染毒組、治療組及對照組的相互對比,闡明中藥拮抗EEDs抗雄激素活性的作用機制。 結(jié)果：(1)確定雄性SD大鼠由EEDs引致性腺發(fā)育不良疾病模型,應(yīng)以21日齡為最佳染毒年齡,以中劑量DEHP (500mg/kg)及CYP (80mg/kg)為最佳染毒劑量,以4周為最佳染毒時間。(2)與對照組相比,DEHP、CYP單獨及聯(lián)合染毒組睪丸下降時間和包皮分離時間明顯延遲,肛門生殖器間距明顯縮短(P0.05或0.01)；各染毒組睪丸重量及睪丸系數(shù)明顯降低,各染毒組血清睪酮水平顯著下降(P0.05或0.01),睪丸勻漿中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性明顯增高,琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDH)活性顯著下降(P0.05或0.01)；DEHP、CYP單獨及聯(lián)合染毒組睪丸病理組織學(xué)、生殖細胞超微結(jié)構(gòu)均可見明顯異常。各治療組與染毒組相比,上述指標均顯著改善(p0.05或0.01)。(3) FQ-PCR方法檢測顯示DEHP、CYP單獨及聯(lián)合染毒可導(dǎo)致StAR、CYP11A1、CYP17A1、3β-HSD、17β-HSD和AR的mRNA表達水平顯著下調(diào)(p0.05或0.01)。而中藥治療干預(yù)可使上述基因表達水平明顯上調(diào)(p0.05或0.01)。(4)經(jīng)Western Blot方法驗證DEHP、CYP單獨及聯(lián)合染毒可導(dǎo)致CYP11A1、CYP17A1、AR的蛋白表達水平顯著下調(diào)(p0.05或0.01)。而中藥治療干預(yù)可使上述蛋白表達水平顯著上調(diào)(p0.05或0.01)。 結(jié)論：(1)我們成功地建立了SD大鼠由EEDs引致的性腺發(fā)育不良疾病模型；(2) DEHP、CYP單獨及聯(lián)合染毒對青春前期雄性大鼠均具有明顯的生殖毒性作用,但二者的作用途徑有所不同,DEHP主要是通過影響睪丸的睪酮合成及損害生精過程而CYP則主要是通過減少AR的表達從而干擾雄激素與其受體的結(jié)合；(3)益腎填精中藥對EEDs的抗雄激素活性及生殖毒性具有顯著的拮抗作用；(4)益腎填精中藥可通過使睪丸的AR以及睪酮合成關(guān)鍵酶的表達上調(diào),多水平、多靶點地發(fā)揮其對EEDs抗雄激素活性及生殖毒性的拮抗作用。
【關(guān)鍵詞】：環(huán)境內(nèi)分泌干擾物 性腺發(fā)育不良 中藥 睪酮合成關(guān)鍵酶 雄激素受體
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R725.8;R-332
【目錄】：

• 主要縮略詞表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 技術(shù)路線14-15
• 第一部分 建立SD大鼠由環(huán)境內(nèi)分泌干擾物引致性腺發(fā)育不良疾病模型15-33
• 1 材料與方法16-23
• 2 結(jié)果23-30
• 3 討論30-32
• 小結(jié)32-33
• 第二部分 中藥對環(huán)境內(nèi)分泌干擾物抗雄激素活性的拮抗作用33-46
• 1 材料與方法33-37
• 2 結(jié)果37-44
• 3 討論44-45
• 小結(jié)45-46
• 第三部分 中藥拮抗環(huán)境內(nèi)分泌干擾物抗雄激素活性的作用機制研究46-71
• 1 材料與方法47-63
• 2 結(jié)果63-69
• 3 討論69-70
• 小結(jié)70-71
• 結(jié)論71
• 創(chuàng)新點71-72
• 參考文獻72-77
• 附錄Ⅰ 鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、氯氰菊酯單獨及聯(lián)合染毒對青春前期雄性大鼠生殖發(fā)育的不良影響77-89
• 參考文獻87-89
• 附錄Ⅱ 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對青春前期雄性大鼠性腺發(fā)育的不良影響及益腎填精中藥的治療作用89-99
• 參考文獻97-99
• 附錄Ⅲ 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的雄性生殖毒性及抗雄激素作用機制99-108
• 參考文獻104-108
• 附錄Ⅳ 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物與兒童性分化、性發(fā)育異常108-119
• 參考文獻115-119
• 在校期間發(fā)表文章119-120
• 致謝120-121

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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2 寧艷花;劉秀芳;關(guān)素珍;薛亞斌;劉桂珠;;乙酰甲胺磷對雄性大鼠生殖細胞及睪丸標志酶活性的影響[J];寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2007年02期

3 蔡紅平;肖雯;朱靜;衷筱琴;;鄰苯二甲酸二乙基己基酯對大鼠睪丸細胞DNA損傷和睪丸組織氧化應(yīng)激影響[J];中國職業(yè)醫(yī)學(xué);2011年06期

4 范奇元,李衛(wèi)華,申立軍,張?zhí)N暉,丁訓(xùn)誠,金泰^，

本文編號：1007487