本文關鍵詞：高原甘加型藏羊發(fā)情周期垂體FSH和LH細胞的表達及其激素分泌的動態(tài)變化研究

  更多相關文章： 甘加型藏羊 發(fā)情周期 垂體 促卵泡素 促黃體素 酶聯(lián)免疫分析法 免疫組織化學 實時熒光定量PCR

【摘要】：研究表明動物的生殖活動主要受下丘腦-垂體-性腺軸(Hypothalamic-pituitar y-gonadal axis,HPGA)的調控,而垂體作為動物繁殖重要的內分泌腺,其垂體前葉嗜堿性細胞合成和分泌的促性腺激素對哺乳動物的性發(fā)育、性成熟、性周期等生理特點起著重要的主導因素。其中卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)和促黃體激素(Luteinizing hormone,LH)直接參與調控母畜的發(fā)情、排卵等生殖過程。因此,研究藏羊垂體組織FSH和LH細胞的形態(tài)與表達,對藏羊生殖活動具有重要意義和應用價值。為了闡明高原甘加型藏羊發(fā)情周期腺垂體FSH和LH細胞的表達及其激素分泌的動態(tài)變化在生殖活動中的作用。本研究(1)對甘加臧羊發(fā)情周期不同階段的垂體組織促卵泡素和促黃體素細胞的分布及其基因mRNA表達和變化規(guī)律進行了研究;(2)對發(fā)情周期不同階段垂體中促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)分泌的動態(tài)變化規(guī)律進行了研究,并觀察了乏情期垂體FSH和LH變化。在繁殖季節(jié)選取年齡2.5~3.5歲,發(fā)育正常的健康未孕雌性高原甘加型藏羊32只,作為發(fā)情周期組,并按發(fā)情周期的不同階段分為4組:發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期、間情期。在非繁殖季節(jié)選取8只年齡2.5-3.5歲,健康未孕的雌性甘加羊作為乏情期組。采集甘加藏羊發(fā)情周期不同階段和乏情期的垂體組織,應用(1)HE染色觀察各組甘加藏羊垂體細胞形態(tài)分布特征;(2)應用免疫組織化學SP法分別對各組藏羊垂體組織中FSH和LH細胞的分布表達變化進行研究,并應用Image pro-plus圖像分析垂體組織中FSH和LH免疫反應陽性產物的光密度表達量;(3)應用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術,對各組藏羊垂體組織中FSHβ和LHβ基因在mRNA水平的動態(tài)表達差異進行研究(4)應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定各組藏羊腺垂體中FSH和LH的含量,分析其在發(fā)情周期的動態(tài)變化規(guī)律。研究結果如下:1.HE染色結果顯示:高原甘加型藏羊發(fā)情周期內腺垂體嗜酸性細胞體積較大,圓形或橢圓形,胞質嗜酸性著色,核圓形,著色較深;嗜堿性細胞體積最大,圓形或多邊形,胞質嗜堿性著色,核圓形,著色較淺;嫌色細胞體積最小,胞質著色很淺,細胞界限不清,核圓形或不規(guī)則形,著色較淺的。并且在發(fā)情周期內三種細胞的生理活動都有所變化。嗜酸性細胞在發(fā)情周期和乏情期分泌顆粒和胞質著色較穩(wěn)定;嗜堿性細胞在發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期分泌顆粒和胞質著色數量逐漸增多,在間情期和乏情期降低:淡染的嫌色細胞幾乎沒有胞質顆粒,但在發(fā)情周期內數量變化明顯,并在間情期和乏情期數量較多。2.免疫組織化學結果顯示:甘加型藏羊發(fā)情周期FSH和LH免疫反應陽性細胞主要分布在垂體的遠側部,中間部很少;發(fā)情期FSH和LH陽性細胞較少,細胞形態(tài)不規(guī)則,胞漿淡染;發(fā)情后期和間情期數量增多,細胞為大中型,形態(tài)多角型或卵圓形,胞漿濃染,且間情期LH陽性細胞數達到最大;發(fā)情前期FSH數量增加達到最大,細胞大,圓形或卵圓形,胞漿濃染;FSH陽性細胞胞漿比LH細胞濃染。FSH和LH陽性反應細胞占垂體中數量的百分比(發(fā)情期、發(fā)情后期、間情期、發(fā)清前期):FSH為9.78%,11.37%,12.81%,13.05%;LH為8.72%,12.73%,14.25%,13.72%,且各時期二者均差異不顯著(p0.05)。3.IPP圖像測算平均光密度顯示:FSH表達量在發(fā)情期較低,發(fā)情后期有所增加,間情期和發(fā)情前期達到最大而與其他時期差異顯著(P0.05);LH表達量在發(fā)情期較低,發(fā)情后期、間情期和發(fā)情前期均增加且差異不顯著(p0.05)。LH表達量除在發(fā)情期低于FSH外,其他時期均高于FSH。4.實時熒光定量PCR顯示:FSHβ和LHβmRNA在發(fā)情周期不同階段甘加型藏羊垂體中均有表達。FSHβmRNA相對表達量(發(fā)清前期、發(fā)情期、發(fā)情后期、間情期)為0.2359±0.017、1±0.2805、3.5475±0.8017、3.6667±1.4492,發(fā)清前期與發(fā)情期、發(fā)情后期和間情期差異極顯著(p0.01),發(fā)情期與發(fā)情后期和間情期差異顯著(p0.05),發(fā)情后期與間情期差異不顯著(p0.05);LHβmRNA相對表達量為0.0259±0.0038、1±0.6318、16.1091±3.2674、0.5638±0.1962,發(fā)情前期與發(fā)情期、發(fā)情后期和間情期差異極顯著(p0.01),發(fā)情期與發(fā)情后期差異極顯著(p0.01),與間情期差異不顯著(p0.05),發(fā)情后期與間情期差異極顯著(p0.01)。5.酶聯(lián)免疫吸附試驗顯示:甘加藏羊發(fā)情周期內腺垂體FSH濃度在間情期最大(8.228mIU/ml),與其他時期差異顯著(P0.05);腺垂體LH濃度在間情期最大(10.629mIU/ml),各時期差異不顯著(P0.05);
【關鍵詞】：甘加型藏羊 發(fā)情周期 垂體 促卵泡素 促黃體素 酶聯(lián)免疫分析法 免疫組織化學 實時熒光定量PCR
【學位授予單位】：甘肅農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S826
【目錄】：

• 摘要5-7
• SUMMARY7-12
• 第一部分：研究背景和研究的意義12-23
• 1.研究背景12-21
• 1.1 藏羊的品種及特性12
• 1.2 下丘腦-垂體-性腺軸調節(jié)機制的研究12-13
• 1.3 促性腺激素分泌規(guī)律的研究13-16
• 1.4.促性腺激素細胞的研究進展16-17
• 1.5 生殖激素在動物繁殖技術中的應用17
• 1.6 雌性動物的生殖周期特點17-19
• 1.7 下丘腦垂體卵巢軸的季節(jié)性變化19
• 1.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）技術19-21
• 2.研究的意義21-23
• 第二部分：甘加型藏羊發(fā)情周期垂體組織中FSH和LH細胞的表達研究23-44
• 1.材料和方法23-29
• 1.1 試驗材料23-24
• 1.2 試驗方法24-29
• 1.2.1 發(fā)情判定和分組24-25
• 1.2.2 石蠟包埋步驟25-26
• 1.2.3 HE染色方法26
• 1.2.4 免疫組織化學26-27
• 1.2.5 對照試驗27
• 1.2.6 甘加型藏羊垂體組織總RNA提取及反轉錄27-28
• 1.2.7 引物的設計與合成28
• 1.2.8 qRT-PCR28
• 1.2.9 FSH和LH陽性細胞形態(tài)觀察和細胞數量統(tǒng)計28
• 1.2.10 數據處理28-29
• 2 結果與分析29-38
• 2.1 甘加型藏羊發(fā)情周期垂體HE染色觀片結果29-30
• 2.2 甘加型藏羊垂體組織FSH免疫陽性細胞分布和表達30-31
• 2.3 甘加型藏羊垂體組織LH免疫陽性細胞分布和表達31-35
• 2.4 甘加型藏羊發(fā)情周期不同階段垂體組織中FSHβ 和LHβmRNA的差異表達35-38
• 3 討論38-42
• 3.1 甘加型藏羊垂體的結構特點38-39
• 3.2 甘加型藏羊發(fā)情周期垂體組織FSH和LH細胞的分布類型39
• 3.3 甘加型藏羊發(fā)情周期垂體組織FSH和LH細胞形態(tài)及數量的變化規(guī)律39-40
• 3.4 甘加型藏羊發(fā)情周期腺垂體FSH和LH的相互關系40-41
• 3.5 甘加型藏羊垂體中FSHβ mRNA和LHβ mRNA表達規(guī)律特點41-42
• 3.6 垂體FSH和LH免疫陽性細胞數目和垂體FSH和LH含量及血漿中FSH和LH之間的關系42
• 4 小結42-44
• 第三部分：甘加型藏羊發(fā)情周期腺垂體和血漿中FSH和LH分泌規(guī)律的研究44-56
• 1.材料和方法44-47
• 1.1 試驗材料與儀器44-45
• 1.2 試驗方法45-47
• 1.2.1 血樣的采集與處理45
• 1.2.2 血樣的制備方法45
• 1.2.3 垂體的采集方法45
• 1.2.4 腺垂體組織液制備方法45-46
• 1.2.5 腺垂體組織和血漿FSH和LH的測定46
• 1.2.6 數據處理46-47
• 2 結果47-51
• 2.1 甘加藏羊發(fā)情周期腺垂體中FSH的分泌變化47
• 2.2 甘加藏羊發(fā)情周期血漿中FSH的分泌變化47-48
• 2.3 甘加藏羊發(fā)情周期腺垂體中LH的分泌變化48
• 2.4 甘加藏羊發(fā)情周期血漿中LH的分泌變化48-50
• 2.5 甘加藏羊發(fā)情周期腺垂體和血漿中FSH和LH之間的的分泌比較50
• 2.6 甘加藏羊發(fā)情周期與乏情期腺垂體和血漿中FSH和LH含量的比較50-51
• 3 討論51-54
• 3.1 甘加藏羊發(fā)情周期腺垂體和血漿中FSH和LH含量及其分泌變化規(guī)律51-52
• 3.2 甘加藏羊腺垂體和血漿中FSH和LH之間的的分泌比較分泌調節(jié)52-53
• 3.3 甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期FSH和LH變化特點53-54
• 3.4 甘加型藏羊發(fā)情周期內FSH和LH分泌峰值的變化特點54
• 4 小結54-56
• 全文結論56-57
• 參考文獻57-66
• 致謝66-67
• 作者簡介67-68
• 導師簡介68-70

【參考文獻】

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本文編號：992867