本文關(guān)鍵詞：牛副流感病毒3型間接ELISA檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

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【摘要】：牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)為單股負(fù)鏈有囊膜的RNA病毒,是引起牛呼吸道綜合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)的重要病原之一,主要引起牛的上呼吸道感染,稱為牛副流行性感冒(Parainfluenza bovum),以支氣管炎、肺炎等呼吸道癥狀為主要特征,嚴(yán)重者甚至能引起流產(chǎn),給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)了巨大的損失。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)BPIV3的研究尚處于起步階段,還沒(méi)有特別有效的BPIV3商品化檢測(cè)試劑盒,鑒于BPIV3強(qiáng)大的傳播能力和巨大的危害性,建立一種方便準(zhǔn)確的BPIV3檢測(cè)方法迫在眉睫。研究發(fā)現(xiàn),BPIV3的NP蛋白是BPIV3中含量最高的蛋白之一,高度保守,其上存在3個(gè)主要抗原表位,有2個(gè)分布在C端。HN蛋白是表面抗原,在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。HN和NP蛋白,都具有很好的作為檢測(cè)抗原的能力。將NP蛋白和HN蛋白抗原表位基因串聯(lián)表達(dá),作為檢測(cè)抗原,在原理上可以放大檢測(cè)效果。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)BPIV3 SD2014株NP蛋白和HN蛋白的氨基酸序列,應(yīng)用Lasergene軟件分別對(duì)這兩個(gè)蛋白的序列進(jìn)行分析,同時(shí)查閱文獻(xiàn)報(bào)道,最終確定NP蛋白的C端388aa~515aa,HN蛋白的C端355aa~572aa為優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)。將選定的NP和HN蛋白抗原表位通過(guò)重疊延伸PCR方法串聯(lián)(命名為NP-HN),構(gòu)建pET28a(+)-NP-HN原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)該串聯(lián)蛋白,將表達(dá)出的蛋白命名為NP-HN融合蛋白。以融合的NP-HN蛋白作為包被抗原,建立了BPIV3間接ELISA診斷方法。本實(shí)驗(yàn)具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.通過(guò)重疊延伸PCR擴(kuò)增技術(shù),成功獲得NP-HN截短串聯(lián)基因,并將其連接至pET28a(+)載體,成功構(gòu)建了原核重組表達(dá)載體pET-28a(+)-NP-HN。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)形成陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),成功表達(dá)了大小為44kDa的NP-HN融合蛋白。2.利用Ni-NTA親和層析方法純化NP-HN融合蛋白,純化后的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證其有較高純度。純化后的蛋白經(jīng)Western-blot檢測(cè),結(jié)果證明NP-HN融合蛋白能識(shí)別BPIV3陽(yáng)性血清。利用Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒對(duì)純化的NP-HN蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定,其蛋白濃度為900μg/ml。3.將純化的NP-HN蛋白免疫3只新西蘭白兔,制備了血清效價(jià)為1:32000的多克隆抗體。利用此多克隆抗體,分別對(duì)BPIV3、BVDV和IBRV全病毒進(jìn)行ELISA檢測(cè),結(jié)果顯示此多克隆抗體能與BPIV3發(fā)生反應(yīng),與BVDV和IBRV不發(fā)生反應(yīng),表明純化的NP-HN蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性和免疫特異性。制備的多克隆抗體經(jīng)western blot檢測(cè),結(jié)果顯示全病毒的NP和HN蛋白能與多克隆抗體結(jié)合,這也間接說(shuō)明融合蛋白NP-HN可以作為間接ELISA方法的檢測(cè)抗原。4.BPIV3間接ELISA診斷方法的建立利用純化后的NP-HN融合蛋白作為包被抗原,建立BPIV3間接ELISA檢測(cè)方法。利用標(biāo)準(zhǔn)的陽(yáng)性血清和陰性血清優(yōu)化反應(yīng)條件,確立最適反應(yīng)條件:抗原包被濃度4μg/ml,37℃包被1h后4℃包被過(guò)夜;封閉液為20%馬血清,37℃封閉1.5h;血清稀釋度為1:50,37℃孵育1h;兔抗牛HRP稀釋度為1:4000,37℃孵育1h;TMB顯色液作用時(shí)間10min,1M H2SO4終止,用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm。確定該ELISA檢測(cè)方法的判定標(biāo)準(zhǔn)為:將待測(cè)樣品OD450nm≥0.30定為陽(yáng)性,OD450nm0.30定為陰性。包被的重組融合蛋白NP-HN與牛病毒性腹瀉粘膜病病毒和牛傳染性鼻氣管炎病毒無(wú)交叉反應(yīng),批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于8%。用所建立間接ELISA診斷方法與血清中和試驗(yàn)比較,總體總符合率為96.67%;與美國(guó)愛(ài)德士BPIV3間接ELISA試劑盒比較,總體符合率為95.56%。5.臨本樣本的檢測(cè)利用所建立的BPIV3間接ELISA診斷方法對(duì)采自山東、遼寧和天津的3個(gè)奶牛場(chǎng)的270份臨床血清樣本進(jìn)行檢測(cè),總的陽(yáng)性率為82.59%,表明上述牛場(chǎng)存在BPIV3的感染與流行。
【關(guān)鍵詞】：牛副流感病毒3型 NP-HN基因 原核表達(dá) 多克隆抗體 ELISA檢測(cè)方法
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.653
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 引言12-21
• 1.1 研究目的與意義12-13
• 1.2 文獻(xiàn)綜述13-19
• 1.2.1 BPIV3病原學(xué)13-17
• 1.2.2 BPIV3流行病學(xué)17
• 1.2.3 BPIV3診斷17-19
• 1.3 研究?jī)?nèi)容19-20
• 1.4 技術(shù)路線20-21
• 2 材料與方法21-29
• 2.1 試驗(yàn)材料21
• 2.1.1 重組菌、病毒、血清及臨床樣品21
• 2.1.2 主要試劑21
• 2.1.3 主要儀器和設(shè)備21
• 2.2 試驗(yàn)方法21-29
• 2.2.1 抗原表位區(qū)域的篩選21-22
• 2.2.2 目的基因的克隆22-25
• 2.2.3 重組原核表達(dá)載體pET28a（+）-NP-HN的構(gòu)建與鑒定25
• 2.2.4 融合蛋白NP-HN的誘導(dǎo)表達(dá)25-26
• 2.2.5 融合蛋白NP-HN可溶性分析26
• 2.2.6 融合蛋白NP-HN的純化、鑒定及濃度測(cè)定26
• 2.2.7 多克隆抗體的制備與檢測(cè)26-27
• 2.2.8 間接ELISA檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化27-28
• 2.2.9 臨床樣品檢測(cè)28-29
• 3 結(jié)果與分析29-41
• 3.1 抗原表位區(qū)的篩選29
• 3.2 NP-HN基因的PCR擴(kuò)增29-30
• 3.3 克隆載體pEASY-T1-NP-HN酶切鑒定30-31
• 3.4 表達(dá)載體pET28a（+）-NP-HN的鑒定31
• 3.5 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、可溶性分析及純化31-32
• 3.6 融合蛋白NP-HN的鑒定32-33
• 3.7 多克隆抗體的制備與檢測(cè)33-34
• 3.7.1 多克隆抗體效價(jià)測(cè)定33
• 3.7.2 多克隆抗體特異性的檢測(cè)33
• 3.7.3 Western blot檢測(cè)多克隆抗體33-34
• 3.8 間接ELISA工作條件的優(yōu)化34-39
• 3.8.1 包被抗原及一抗的最佳稀釋濃度34-35
• 3.8.2 抗原包被的最佳條件的確定35
• 3.8.3 最適封閉液及封閉時(shí)間的選擇35-36
• 3.8.4 最佳二抗?jié)舛鹊倪x擇36
• 3.8.5 最佳顯色時(shí)間的選擇36-37
• 3.8.6 BPIV3間接ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)37
• 3.8.7 特異性試驗(yàn)37-38
• 3.8.8 敏感性試驗(yàn)38
• 3.8.9 重復(fù)性試驗(yàn)38-39
• 3.8.10 符合率試驗(yàn)39
• 3.9 臨床樣品檢測(cè)39-41
• 4 討論41-44
• 4.1 目的基因的選擇41
• 4.2 NP-HN融合蛋白的原核表達(dá)41-42
• 4.3 多克隆抗體的制備42
• 4.4 間接ELISA方法的建立42-44
• 5 結(jié)論44-45
• 致謝45-46
• 參考文獻(xiàn)46-53
• 附錄53-54
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文54

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王璋瑜;;蛋白設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室公司買下融合蛋白技術(shù)實(shí)用權(quán)[J];生物技術(shù)通報(bào);1990年10期

2 張毅,屈賢銘,楊勝利;融合蛋白基因工程應(yīng)用及研究[J];生物工程進(jìn)展;2000年03期

3 楊林,李國(guó)清,黃葆英,王全忠,龍綮新,王s閼，

本文編號(hào)：991108