本文關(guān)鍵詞：嵌合犬細(xì)小病毒VP2基因重組狂犬病毒的拯救與鑒定

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【摘要】：狂犬病是由狂犬病毒感染引起的一種人畜共患病,發(fā)病后死亡率幾乎達(dá)到100%,是人類病死率最高的急性傳染病之一。犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒感染引起的一種高度接觸性傳染病,主要引起犬的出血性腸炎和非化膿性心肌炎。犬細(xì)小病毒衣殼的主要成分是VP2蛋白,該蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,是研制犬細(xì)小病毒基因工程疫苗的主要蛋白。本研究首先對(duì)采集自2013~2014年河北以及甘肅的10株犬細(xì)小病毒病料進(jìn)行VP2基因克隆與序列分析,并對(duì)基因型進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,CPV-2a型占80%,CPV-2b型占20%,表明河北與甘肅地區(qū)流行的犬細(xì)小病毒病以CPV-2a型為主。然后通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出犬細(xì)小病毒的VP2蛋白,純化后免疫豚鼠,制備多克隆抗體,經(jīng)Western blotting分析證實(shí)了所表達(dá)的VP2蛋白具有良好的反應(yīng)原性和免疫原性。另外,本研究基于狂犬病毒反向遺傳操作系統(tǒng)進(jìn)行了犬細(xì)小病毒和狂犬病毒二聯(lián)基因工程疫苗的研究。以致弱的狂犬病毒BNSP為載體,構(gòu)建嵌合犬細(xì)小病毒VP2基因的狂犬病毒全長(zhǎng)cDNA。將全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞,免疫熒光顯示重組病毒rBNSP-CPV-VP2在細(xì)胞中拯救成功。然后對(duì)該重組病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定,將重組病毒在Vero E6細(xì)胞中連續(xù)傳8代,對(duì)第1、3、5代病毒進(jìn)行滴度測(cè)定,毒價(jià)最高達(dá)109FFU/mL;RT-PCR證實(shí)了VP2基因的遺傳穩(wěn)定性;Western blotting顯示VP2蛋白在重組病毒中成功表達(dá)。進(jìn)一步利用BALB/c小鼠模型對(duì)該重組病毒的致病性和免疫特性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。小鼠致病性結(jié)果顯示,注射重組病毒后,小鼠未現(xiàn)肉眼可見的臨床癥狀。對(duì)重組病毒進(jìn)行滅活,經(jīng)安全檢驗(yàn)合格后,與GEL佐劑按一定的比例制備疫苗,同時(shí)設(shè)抗原組和PBS對(duì)照組。于0,14天免疫小鼠兩次,在7、14、21、28、35天采血,通過ELISA方法檢測(cè)狂犬病毒和犬細(xì)小病毒IgG抗體,并用RFFIT的方法檢測(cè)狂犬病毒中和抗體。通過ELISPOT檢測(cè)細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的分泌水平;在28天用30個(gè)LD50的CVS進(jìn)行腦內(nèi)攻擊,評(píng)價(jià)疫苗保護(hù)效果。ELISA和ELISPOT結(jié)果顯示免疫BNSP-VP2組和BNSP-VP2+GEL組都可以誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,GEL佐劑可以增強(qiáng)免疫應(yīng)答水平。RFFIT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明首免后28天時(shí)BNSP-VP2組和BNSP-VP2+GEL組的中和抗體水平分別可以達(dá)到7.19 IU/mL和21.21 IU/mL。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,免疫BNSP-VP2的小鼠保護(hù)率達(dá)到66.67%,免疫BNSP-VP2+GEL的小鼠保護(hù)率達(dá)到100%。綜上,本研究分析了犬細(xì)小病毒在我國(guó)部分省區(qū)的流行現(xiàn)狀,原核表達(dá)了犬細(xì)小病毒VP2蛋白。利用反向遺傳技術(shù)拯救出嵌合犬細(xì)小病毒VP2基因的重組狂犬病毒,用滅活的重組抗原制備的疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生較高的狂犬病毒和犬細(xì)小病毒的特異性抗體,并能抵抗狂犬病毒致死性攻擊,為犬細(xì)小病毒和和狂犬病毒基因工程二聯(lián)苗的研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：狂犬病毒 犬細(xì)小病毒 反向遺傳 VP2 免疫
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 英文縮略表13-14
• 第一章 引言14-24
• 1.1 狂犬病概述14-17
• 1.1.1 狂犬病14
• 1.1.2 狂犬病流行病學(xué)14
• 1.1.3 狂犬病臨床癥狀與致病機(jī)理14-15
• 1.1.4 狂犬病毒基因組結(jié)構(gòu)及編碼蛋白15-16
• 1.1.5 狂犬病毒的生活周期16
• 1.1.6 狂犬疫苗研究進(jìn)展16-17
• 1.2 犬細(xì)小病毒病概述17-19
• 1.2.1 犬細(xì)小病毒病17
• 1.2.2 犬細(xì)小病毒起源與演化17-18
• 1.2.3 犬細(xì)小病毒病的臨床癥狀與致病機(jī)理18
• 1.2.4 犬細(xì)小病毒分類學(xué)和結(jié)構(gòu)18-19
• 1.2.5 犬細(xì)小病毒疫苗研究進(jìn)展19
• 1.3 負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳操作和應(yīng)用19-23
• 1.3.1 負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳操作19-21
• 1.3.2 負(fù)鏈RNA病毒拯救過程的優(yōu)化21
• 1.3.3 反向遺傳技術(shù)在狂犬病毒中的應(yīng)用21-23
• 1.4 目的與意義23-24
• 第二章 犬細(xì)小病毒VP2基因克隆分析及原核表達(dá)24-33
• 2.1 材料與方法24-27
• 2.1.1 病料24
• 2.1.2 主要試劑24-25
• 2.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成25
• 2.1.4 VP2基因的克隆與測(cè)序25-26
• 2.1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定26
• 2.1.6 VP2蛋白的原核表達(dá)及Western Blotting鑒定26
• 2.1.7 VP2蛋白切膠免疫豚鼠及豚鼠血清的免疫學(xué)鑒定26-27
• 2.2 結(jié)果與分析27-31
• 2.2.1 VP2基因的擴(kuò)增以及序列分析27-28
• 2.2.2 VP2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析28-29
• 2.2.3 目的蛋白表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定結(jié)果29-30
• 2.2.4 VP2蛋白的表達(dá)和Western Blotting檢測(cè)30-31
• 2.2.5 多克隆抗體的制備及免疫原性分析31
• 2.3 討論31-33
• 第三章 重組病毒RBNSP-CPV-VP2的拯救及生物學(xué)特性研究33-40
• 3.1 材料與方法33-36
• 3.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞33
• 3.1.2 主要試劑33-34
• 3.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成34
• 3.1.4 PCR擴(kuò)增犬細(xì)小病毒VP2基因34
• 3.1.5 表達(dá)VP2蛋白重組狂犬病毒基因組全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建34
• 3.1.6 重組病毒的拯救34-35
• 3.1.7 免疫熒光鑒定重組病毒35
• 3.1.8 重組病毒的傳代和毒價(jià)測(cè)定35
• 3.1.9 Western Blotting鑒定外源蛋白表達(dá)35
• 3.1.10 外源基因穩(wěn)定性檢測(cè)35-36
• 3.2 結(jié)果36-39
• 3.2.1 犬細(xì)小病毒VP2基因的擴(kuò)增結(jié)果36
• 3.2.2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果36-37
• 3.2.3 免疫熒光鑒定重組病毒結(jié)果37
• 3.2.4 rBNSP-CPV-VP2毒價(jià)測(cè)定結(jié)果37-38
• 3.2.5 Western Blotting鑒定外源蛋白的表達(dá)結(jié)果38
• 3.2.6 外源基因穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果38-39
• 3.3 討論39-40
• 第四章 重組病毒對(duì)小鼠的免疫效果評(píng)價(jià)40-49
• 4.1 材料與方法40-43
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、病毒40
• 4.1.2 主要試劑40
• 4.1.3 重組病毒對(duì)小鼠的毒力試驗(yàn)40-41
• 4.1.4 疫苗的制備與免疫41
• 4.1.5 狂犬病毒IgG抗體檢測(cè)41
• 4.1.6 RFFIT檢測(cè)狂犬病毒中和抗體41-42
• 4.1.7 間接ELISA方法檢測(cè)VP2抗體42
• 4.1.8 ELISPOT檢測(cè)細(xì)胞因子IL-4 和IFN-Γ42-43
• 4.1.9 攻毒保護(hù)試驗(yàn)43
• 4.1.10 數(shù)據(jù)分析43
• 4.2 結(jié)果43-47
• 4.2.1 重組病毒對(duì)小鼠的毒力檢測(cè)結(jié)果43
• 4.2.2 狂犬病毒IgG抗體檢測(cè)結(jié)果43-44
• 4.2.3 狂犬病毒中和抗體檢測(cè)結(jié)果44-45
• 4.2.4 犬細(xì)小病毒抗體檢測(cè)結(jié)果45-46
• 4.2.5 IL-4 和IFN-Γ 檢測(cè)結(jié)果46-47
• 4.2.6 小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果47
• 4.3 討論47-49
• 第五章 全文結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-57
• 致謝57-58
• 作者簡(jiǎn)歷58

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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本文編號(hào)：988864