發(fā)布時間：2017-10-06 11:36

  本文關(guān)鍵詞：羊口瘡病毒和山羊痘病毒的分離鑒定及羊口瘡病毒B2L蛋白單克隆抗體的研制

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【摘要】：羊口瘡病毒(Orf virus, ORFV)可感染山羊、綿羊和其他野生或家養(yǎng)的小反芻獸引起羊接觸性傳染性膿皰(Contagious ecthyma, CE),又名羊口瘡(Orf)。雖然感染在1-2月內(nèi)可自行康復(fù),但繼發(fā)感染和生長緩慢同樣嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展。山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)可感染各種年齡、性別、品種的山羊,有報(bào)道稱也可感染綿羊,引起急性熱性接觸性山羊痘病,該病最典型的臨床癥狀為皮膚粘膜出現(xiàn)廣泛性痘疹,羔羊、泌乳羊及老年羊發(fā)病嚴(yán)重,后期多因衰竭死亡,孕羊大多發(fā)生流產(chǎn),嚴(yán)重威脅國內(nèi)反芻動物的生長繁殖,是OIE規(guī)定的必須申報(bào)疾病之一,在GTPV流行地區(qū)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。羊口瘡和羊痘在臨床癥狀上十分相似,血清學(xué)診斷又存在交叉反應(yīng),同時混合感染也時有發(fā)生,一般很難快速鑒別,給疾病的治療造成很多不必要的麻煩。本實(shí)驗(yàn)從江蘇地區(qū)部分養(yǎng)殖場(戶)采集病死羊病料,利用細(xì)胞培養(yǎng)從中分離GTPV和ORFV,通過PCR、遺傳進(jìn)化分析等方法對其進(jìn)行鑒定,克隆表達(dá)了ORFV B2L蛋白并制備相應(yīng)的單克隆抗體。取得了如下結(jié)果：1.2013-2015年江蘇部分地區(qū)ORFV和GTPV的分離鑒定共采集羊病料121份,對其進(jìn)行細(xì)菌分離和病毒分離鑒定。其中ORFV PCR檢測陽性有4份,分別將其命名為ORFV/Ovis/XZ/Jiangsu/2015/China、 ORFV1/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China、ORFV2/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China和ORFV/Ovis/SL/Jiangsu/2015/China。其中有1份是和GTPV混合感染的,擴(kuò)增ORFV B2L基因全長并繪制遺傳進(jìn)化樹,結(jié)果表明,XZ株和DT株核酸同源性分別為100.0%、98.6%、98.6%,與SC-JY、GX-YB、JS-FX株聚成一簇,核酸同源性分別為99.9%、100.0%、99.2%和98.5%、98.6%、97.8%。SL株與其他3株核酸同源性分別為98.8%、98.8%、98.5%,與LiaoNing、HuB、Gansu株親緣關(guān)系接近,核酸同源性分別為98.8%、98.9%、98.9%。4株分離株與中國疫苗株的核酸同源性為96.8%-98.8%。用胎羊鼻甲骨細(xì)胞(OFTu)和MDBK細(xì)胞系對其進(jìn)行分離,成功分離出2株。GTPV PCR檢測陽性有2份,將其命名為Goatpox/WX/Jiangsu/2014/China和Goatpox/XZ/Jiangsu/2014/China.2株分離株與EF514890、 EF522177、EF514892、HM572329、JN596275、EF514891株等聚成一簇,同源性接近,其中Goatpox/WX/Jiangsu/2014/China與其核酸同源性分別為98.7%-99.1%,Goatpox/XZ/Jiangsu/2014/China與其核酸同源性分別為99.4%-99.5%,與中國疫苗株的核酸同源性分別為98.6%和99.3%。擴(kuò)增其P32全長基因繪制遺傳進(jìn)化樹,結(jié)果表明,與其他地區(qū)分離株核苷酸序列同源性分別為97.3%-100%、97.7%-99.6%。用胎羊睪丸細(xì)胞(LT)和BHK-21細(xì)胞對其進(jìn)行分離,成功分離出1株。2. ORFV和GTPV多重PCR檢測方法的建立選擇羊口瘡病毒和羊痘病毒各自的保守基因P32和VIR,分別設(shè)計(jì)特異性引物,建立多重PCR (mPCR)檢測方法。該方法特異性和廣譜性較好,提取病料DNA的敏感度結(jié)果顯示,鑒別羊痘、羊口瘡病毒的最低檢出量分別為0.098 ng/μL和0.46ng/μL,可在同一個PCR反應(yīng)體系中快速鑒定羊痘、羊口瘡病毒感染或是兩者混合感染。3.ORFV B2L基因的原核表達(dá)克隆ORFV的囊膜蛋白B2L基因,并將其插入pET-32a,轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21。 SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示,在37℃、200rpm、0.6M IPTG條件下,融合蛋白B2L-His以可溶性形式大量表達(dá)。經(jīng)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)純化后,重組蛋白濃度為4.183 mg/mL。4.抗B2L蛋白單克隆抗體的制備以純化的His-B2L融合蛋白免疫六周齡Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0進(jìn)行融合,通過間接ELISA方法篩選出與B2L蛋白反應(yīng)呈陽性,與His蛋白反應(yīng)呈陰性的孔進(jìn)行亞克隆,獲得1株能穩(wěn)定分泌抗B2L蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為6D5。IFA結(jié)果顯示,該株單抗與感染ORFV的MDBK細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生特異性綠色熒光;Western-blot試驗(yàn)結(jié)果表明該株單抗與B2L蛋白反應(yīng),而與His蛋白不反應(yīng)。綜上所述,ORFV和GTPV在江蘇省仍有流行,存在潛在的爆發(fā)危險(xiǎn),應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測。對ORFV、GTPV的分子流行病學(xué)調(diào)查以及研制基于單抗隆抗體的檢測技術(shù)對疾病的防控具有非常重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：ORFV GTPV B2L蛋白 原核表達(dá) 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 符號說明8-9
• 文獻(xiàn)綜述9-22
• 參考文獻(xiàn)17-22
• 第一章 江蘇部分地區(qū)羊口瘡、羊痘病毒的分離鑒定22-38
• 1 材料22-23
• 2 方法23-26
• 3 結(jié)果26-35
• 4 討論35-37
• 參考文獻(xiàn)37-38
• 第二章 羊口瘡、羊痘病毒多重PCR檢測方法的建立38-45
• 1 材料與方法38-39
• 2 結(jié)果39-41
• 3 討論41-43
• 參考文獻(xiàn)43-45
• 第三章 羊口瘡病毒B2L基因的原核表達(dá)45-55
• 1 材料45-46
• 2. 方法46-50
• 3. 結(jié)果50-52
• 4 討論52-54
• 參考文獻(xiàn)54-55
• 第四章 羊口瘡B2L蛋白單克隆抗體的制備55-67
• 1. 試劑和材料55-56
• 2 方法56-60
• 3 結(jié)果60-64
• 4 討論64-66
• 參考文獻(xiàn)66-67
• 全文總結(jié)67-68
• 致謝68-69
• 發(fā)表論文69-70

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：982598