本文關(guān)鍵詞：基于細(xì)胞自噬對(duì)車前草多糖的免疫藥理機(jī)制研究

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【摘要】：車前草最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,是《中國(guó)藥典》(2015年版)收載的常用中藥,具有清熱解毒、祛痰利尿之功效�，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)車前草中含有多糖類、黃酮類、熊果酸及苷類等多種活性成分,具有鎮(zhèn)咳平喘、抗菌和抗氧化等作用。近期的一些研究發(fā)現(xiàn),車前草的多糖成分——車前草多糖(Plantago asiatica Polysaccharide,PLP)在促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體免疫器官發(fā)育、免疫細(xì)胞增殖以及提高疫苗免疫抗體效價(jià)等方面都具有明顯的效果,但其免疫藥理作用機(jī)理尚不明確。細(xì)胞自噬(Autophagy)是機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要組成部分,參與病原的清除、炎癥反應(yīng)以及抗原呈遞等方面的作用。研究發(fā)現(xiàn),自噬信號(hào)調(diào)控途徑的mTOR(Mammalian Target of Rapamycin)調(diào)控途徑和mTOR不依賴性(Ⅲ-PI3K)調(diào)控途徑,同時(shí)也是免疫分子及藥物進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的有效途徑。近年來(lái),一些中藥及有效成分如姜黃素、苦參堿、氨茶堿誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞發(fā)生自噬的研究,使細(xì)胞自噬成為了探索中醫(yī)藥藥理作用機(jī)制的新途徑。本研究基于細(xì)胞自噬調(diào)控途徑以及細(xì)胞自噬與固有免疫的TLR4/NF-κB信號(hào)通路的交互作用,研究車前草多糖對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用及其免疫藥理作用機(jī)制,擬明確車前草多糖的免疫藥理作用靶位,為車前草多糖成為一種新型免疫調(diào)節(jié)劑提供試驗(yàn)依據(jù)。試驗(yàn)主要結(jié)果及結(jié)論如下:1.車前草多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬的影響試驗(yàn)以LPS誘導(dǎo)Raw264.7巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬,分別以車前草多糖的低(25μg/mL)、中(50μg/mL)、高(100μg/mL)三種不同劑量進(jìn)行干預(yù),用MDC熒光染色檢測(cè)自噬體的聚積程度,用Western-blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的蛋白表達(dá)水平,和用熒光定量PCR檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的mRNA表達(dá)水平,研究車前草多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示,車前草多糖使LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬體熒光聚積增多;對(duì)LC3Ⅱ/Ⅰ比值及LC3 mRNA表達(dá)水平、Beclin-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)作用。其中,車前草多糖中劑量干預(yù)組的LC3Ⅱ/Ⅰ比值在20h時(shí)顯著高于LPS組(P0.01),LC3 mRNA表達(dá)水平在2h、16h、20h、24h時(shí)顯著高于LPS組(P0.05);車前草多糖高劑量干預(yù)組的LC3Ⅱ/Ⅰ比值在16h、20h、24h顯著高于LPS組(P0.05或P0.01),LC3 mRNA表達(dá)水平在2h、16h、20h、24h時(shí)顯著高于LPS組(P0.05)。車前草多糖中劑量干預(yù)組的beclin-1蛋白表達(dá)水平在16h、20h、24h時(shí)顯著高于lps組(p0.05或p0.01),beclin-1mrna表達(dá)水平在16h時(shí)顯著高于lps組(p0.05);車前草多糖高劑量干預(yù)組的beclin-1蛋白表達(dá)水平在16h、20h、24h時(shí)顯著高于lps組(p0.01),beclin-1mrna表達(dá)水平在2h、8h、16h、20h顯著高于lps組(p0.05或p0.01)。試驗(yàn)結(jié)果表明,車前草多糖能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的自噬體數(shù)量增加,上調(diào)lc3和beclin-1的表達(dá)水平,對(duì)lps誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬具有促進(jìn)作用。2.車前草多糖對(duì)細(xì)胞自噬mtor和Ⅲ-pi3k調(diào)控通路的影響通過(guò)對(duì)細(xì)胞自噬mtor和Ⅲ-pi3k調(diào)控通路的正向試驗(yàn)及阻斷試驗(yàn),研究車前草多糖調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制。試驗(yàn)以lps誘導(dǎo)raw264.7細(xì)胞發(fā)生自噬,并分別使用抑制劑——雷帕霉素(rapamycin)和3-甲基腺嘌呤(3-ma)對(duì)mtor和Ⅲ-pi3k調(diào)控通路進(jìn)行阻斷,用western-blot和熒光定量pcr技術(shù)檢測(cè)自噬調(diào)控通路相關(guān)分子mtor、ulk1、beclin-1、Ⅲ-pi3k的蛋白及mrna表達(dá)水平。試驗(yàn)結(jié)果顯示,lps組與空白對(duì)照組相比,lc3Ⅱ/Ⅰ比值及l(fā)c3mrna表達(dá)水平顯著增高(p0.01),mtor蛋白及mrna表達(dá)減少(p0.05),ulk1的蛋白及mrna表達(dá)增加(p0.05);Ⅲ-pi3k蛋白及mrna表達(dá)增加(p0.05),beclin-1的蛋白及mrna表達(dá)顯著增加(p0.05或p0.01)。車前草多糖干預(yù)后,與lps組比較,lc3Ⅱ/Ⅰ比值顯著增高(p0.05),ulk1和Ⅲ-pi3k的蛋白表達(dá)水平增高但差異不顯著(p0.05),beclin-1的蛋白及mrna表達(dá)水平顯著增高(p0.05或p0.01)。當(dāng)雷帕霉素抑制mtor通路時(shí),lc3Ⅱ/Ⅰ比值及l(fā)c3mrna表達(dá)水平較lps組顯著增高(p0.05或p0.01),其中l(wèi)ps+rapa+plp組顯著低于lps+rapa組(p0.05或p0.01);ulk1的蛋白及mrna表達(dá)水平較lps組無(wú)顯著差異(p0.05),其中l(wèi)ps+rapa+plp組的ulk1蛋白表達(dá)水平顯著高于lps+rapa組(p0.05)。當(dāng)3-ma抑制Ⅲ-pi3k通路時(shí),lc3Ⅱ/Ⅰ比值及l(fā)c3mrna表達(dá)水平較lps組顯著降低(p0.01),其中l(wèi)ps+3-ma+plp組與lps+3-ma組之間無(wú)顯著差異(p0.05);beclin-1的蛋白及mrna表達(dá)水平較lps組顯著降低(p0.05),其中l(wèi)ps+3-ma+plp組的beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著低于lps+3-ma組(p0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明,車前草多糖可通過(guò)激活Ⅲ-pi3k通路促進(jìn)細(xì)胞自噬,其作用機(jī)制與上調(diào)ulk1和beclin-1的表達(dá)有關(guān)。3.車前草多糖在tlr4/nf-κb通路與自噬調(diào)控通路交互作用中的調(diào)節(jié)機(jī)制通過(guò)對(duì)tlr4/nf-κb通路與自噬調(diào)控通路的正向和阻斷試驗(yàn),研究車前草多糖在固有免疫的tlr4/nf-κb信號(hào)通路與自噬調(diào)控通路交互作用中的調(diào)節(jié)機(jī)制。試驗(yàn)以lps誘導(dǎo)raw264.7細(xì)胞發(fā)生自噬,使用雷帕霉素和3-ma分別阻斷mtor和Ⅲ-pi3k自噬調(diào)控通路,通過(guò)熒光定量pcr檢測(cè)tlr4/nf-κb通路中tlr4、myd88、trif、nf-κb的mrna表達(dá)水平、及western-blot檢測(cè)nf-κbp65的磷酸化水平的變化;并用抑制劑bay11-7082阻斷nf-κb通路,用western-blot和熒光定量pcr檢測(cè)自噬相關(guān)分子lc3、beclin-1、Ⅲ-pi3k、mtor的蛋白及mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示,LPS處理Raw264.7細(xì)胞后,TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表達(dá)水平以及NF-κB p65磷酸化水平較空白對(duì)照組顯著增高(P0.05或P0.01)。經(jīng)車前草多糖干預(yù)后,TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表達(dá)水平以及NF-κB p65磷酸化水平較LPS組均有不同程度的升高。當(dāng)雷帕霉素抑制mTOR通路時(shí),NF-κB p65的磷酸化水平較LPS組顯著降低(P0.01),其中LPS+Rapa組和LPS+Rapa+PLP組之間無(wú)顯著差異(P0.05);TRIF mRNA表達(dá)水平較LPS組顯著增高(P0.05或P0.01),并且LPS+Rapa+PLP組顯著低于LPS+Rapa組(P0.05)。當(dāng)3-MA抑制Ⅲ-PI3K通路時(shí),NF-κB mRNA表達(dá)水平較LPS組顯著增高(P0.01),其中LPS+3-MA+PLP組低于LPS+3-MA組但無(wú)顯著差異(P0.05)。當(dāng)BAY11-7082抑制NF-κB通路時(shí),LC3Ⅱ/Ⅰ比值及LC3 mRNA表達(dá)水平較LPS組明顯降低,其中LPS+BAY+PLP組和LPS+BAY組之間無(wú)顯著差異(P0.05);mTOR的蛋白及mRNA表達(dá)水平較LPS組顯著增高(P0.05或P0.01),其中LPS+BAY+PLP組和LPS+BAY組之間無(wú)顯著差異(P0.05);Beclin-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平較LPS組顯著降低(P0.05或P0.01),其中LPS+BAY+PLP組的Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著低于LPS+BAY組(P0.01);Ⅲ-PI3K的mRNA表達(dá)水平較LPS組顯著降低(P0.01),其中LPS+BAY+PLP組和LPS+BAY組之間無(wú)顯著差異(P0.05)。研究結(jié)果表明,車前草多糖可通過(guò)協(xié)同激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的自噬,在自噬通路與TLR4/NF-κB通路的交互作用中,Ⅲ-PI3K通路和TLR4/NF-κB通路中的重要節(jié)點(diǎn)分子為車前草多糖調(diào)節(jié)自噬與固有免疫的潛在靶標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：車前草多糖 自噬 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶 巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S853.74
【目錄】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 第1章 文獻(xiàn)綜述14-24
• 1.1 車前草多糖的研究概況14-15
• 1.2 細(xì)胞自噬與免疫15-21
• 1.3 細(xì)胞自噬在中藥藥理機(jī)制中的研究21-24
• 第2章 引言24-26
• 2.1 研究目的與意義24
• 2.2 研究范圍與內(nèi)容24-26
• 第3章 車前草多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬的影響26-42
• 3.1 試驗(yàn)材料26-27
• 3.2 試驗(yàn)方法27-32
• 3.3 試驗(yàn)結(jié)果32-39
• 3.4 討論39-42
• 第4章 車前草多糖對(duì)細(xì)胞自噬Ⅲ-PI3K和mTOR調(diào)控通路的影響42-52
• 4.1 試驗(yàn)材料42
• 4.2 試驗(yàn)方法42-43
• 4.3 試驗(yàn)結(jié)果43-50
• 4.4 討論50-52
• 第5章 車前草多糖在TLR4/NF-κB通路與自噬調(diào)控通路交互作用中的調(diào)節(jié)機(jī)制52-62
• 5.1 試驗(yàn)材料52-53
• 5.2 試驗(yàn)方法53
• 5.3 試驗(yàn)結(jié)果53-59
• 5.4 討論59-62
• 第6章 結(jié)論62-64
• 參考文獻(xiàn)64-72
• 附錄 172-73
• 附錄 273-76
• 致謝76

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本文編號(hào)：979734