本文關鍵詞：綿羊MITF-M在黑素細胞中過表達后的功能分析

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【摘要】：【目的】小眼畸形相關轉(zhuǎn)錄因子-M型(microphthalmia associated transcription factor M,MITF-M)在動物皮膚和毛發(fā)的黑色素合成途徑中發(fā)揮重要作用,克隆綿羊小眼畸形相關轉(zhuǎn)錄因子-M型基因序列,研究在綿羊黑素細胞中過表達綿羊MITF-M是否影響TYR、TYRP-1和TYRP-2的表達,從而探究對黑色素的生成的影響。【方法】使用試驗室凍存的第5代綿羊黑素細胞,通過PCR方法用引物以綿羊黑素細胞cDNA為模板克隆MITF-M基因cDNA序列,構建綿羊MITF-M克隆載體和真核表達載體;通過細胞轉(zhuǎn)染技術在細胞水平過量表達綿羊MITF-M;轉(zhuǎn)染后使用熒光顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染效率,采用分光光度計對綿羊黑素細胞中黑色素含量進行測定,并進行Real-time PCR試驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞MITF、TYR、TYRP-1和TYRP-2基因在mRNA水平表達量的變化,Western blot試驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞MITF、TYR蛋白水平的變化�！窘Y果】經(jīng)測序和拼接,最終獲得長度為1 242 bp的綿羊MITF-M基因的cDNA序列;成功構建真核表達載體,載體上連有一個啟動報告基因綠色熒光蛋白和特異性TYRP-2基因啟動子;細胞轉(zhuǎn)染后,在熒光顯微鏡下可觀察到黑素細胞帶有綠色熒光說明轉(zhuǎn)染效率明顯;分光光度計檢測顯示,轉(zhuǎn)染后綿羊黑素細胞中黑色素量增加1.15倍(P0.05);熒光定量檢測結果顯示,綿羊黑素細胞中MITF mRNA表達量增加極顯著(P0.001),表明綿羊MITF-M轉(zhuǎn)染效率顯著,TYR mRNA表達量增加極顯著(P0.001),TYRP-1 mRNA表達量升高至5.06倍(P0.05),TYRP-2 mRNA表達量升高至1.49倍,變化不明顯。蛋白免疫印跡結果顯示,綿羊黑素細胞中MITF-M轉(zhuǎn)染組MITF蛋白表達量是空載體組的1.65倍(P0.001),轉(zhuǎn)染組TYR蛋白表達量是空載體組的2.38倍(P0.001),這與熒光定量檢測結果一致�！窘Y論】通過PCR和克隆技術及核酸測序技術獲得了綿羊MITF-M基因全長1 242 bp的CDS區(qū),過表達綿羊MITF-M會使黑素細胞TYR、TYRP-1的表達量增加,對TYRP-2的表達量變化不明顯,從而揭示綿羊MITF-M可以通過調(diào)節(jié)TYR和TYRP-1的表達量控制綿羊黑素細胞中黑色素的生成。
【作者單位】： 山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院;山西醫(yī)科大學晉祠學院;山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院;
【關鍵詞】： 小眼畸形相關轉(zhuǎn)錄因子(MITF) TYR TYRP- TYRP-
【基金】：國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303119) 國家高科技研究發(fā)展計劃(863計劃,2013AA102506) 山西農(nóng)業(yè)大學創(chuàng)新團隊
【分類號】：S826
【正文快照】： The Function Analysis of Over-Expression ofOar MITF-M in MelanocytesYANG Yu-jing1,ZHANG DAN-Jin2,NIE Rui-qiang1,XIE Jian-shan1,3,FAN Rui-wen1,【研究意義】綿羊毛是毛紡工業(yè)最主要原料,毛色成為了主要經(jīng)濟特性。如今研究毛色種類,成為毛色研究的主要方向,而毛色的

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