本文關(guān)鍵詞：鴨源H6N6亞型禽流感病毒的分離鑒定與致病性分析

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【摘要】：禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正黏病毒科A型流感病毒屬成員,能感染所有鳥類和大部分哺乳動(dòng)物。根據(jù)HA和NA蛋白抗原性差異,AIV可分為18個(gè)HA亞型(H1~H18)和11個(gè)NA亞型(N1~N11)。水禽被認(rèn)為是AIV的巨大天然儲(chǔ)存庫(kù),幾乎所有亞型AIV均能從水禽中分離到。對(duì)水禽中AIV攜帶情況調(diào)查結(jié)果表明,H6亞型AIV是分離率最高的低致病性AIV。最近的研究發(fā)現(xiàn),人感染的H5N6亞型AIV主要是由H5N1和H6N6病毒發(fā)生基因重排引起的。因此加強(qiáng)對(duì)H6亞型AIV的監(jiān)測(cè)和遺傳變異分析具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)于2014年11月從表觀健康三穗鴨泄殖腔分離鑒定得到一株H6N6亞型AIV,通過對(duì)其全基因組測(cè)序、遺傳進(jìn)化和致病性分析,旨在為家鴨中H6亞型AIV流行病學(xué)及遺傳進(jìn)化情況提供參考。1.H6N6亞型AIV分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析:為了解貴州地區(qū)H6亞型AIV的流行情況和遺傳進(jìn)化特點(diǎn),本研究采用雞胚接種、血清學(xué)和RT-PCR方法從表觀健康的三穗鴨泄殖腔分離鑒定得到一株H6N6亞型AIV(命名為A/duck/Guizhou/013/2014(H6N6),并對(duì)其進(jìn)行部分生物學(xué)特性測(cè)定、全基因組測(cè)序與遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明,分離株HA裂解位點(diǎn)是“339PQIETRG345”,為非連續(xù)堿性氨基酸,其MDT和ICPI分別為98.4 h和0.415,符合低致病性AIV的特征。BLAST結(jié)果顯示分離株HA基因與A/chicken/Hunan/S41912/2009(H6N2)的核苷酸同源性最高(97.1%);NA基因與A/duck/Eastern China/48/2010(H6N6)的相似性最高(97.0%);而PB2基因與A/duck/Yamagata/061004/2014(H6N6)的同源性最高(96.9%),M基因與NP基因則分別與A/duck/Jiangsu/4/2010(H3N6)和A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)同源性最高。以上研究結(jié)果表明,貴州省分離到的H6N6亞型AIV是一株弱毒株,其基因組可能是由H6N2、H3N6和H5N1等多個(gè)亞型病毒重組而成。2.鴨源H6N6亞型AIV對(duì)鴨致病性研究:為了解鴨源H6N6亞型AIV對(duì)麻鴨的致病性,將36只3周齡非免疫麻鴨隨機(jī)分成兩組:實(shí)驗(yàn)組以107.0EID50/0.1 mL的劑量通過滴鼻點(diǎn)眼方式接種病毒;對(duì)照組接種0.1 mL PBS。接種后分別于第1、3、5、7、9和11 d,采集咽喉和泄殖腔棉拭子,同時(shí)采集剖殺鴨的組織臟器(心、肝、脾、肺、腎、腦、法氏囊、胸腺),通過熒光定量RT-PCR來檢測(cè)病毒排毒和組織臟器中病毒含量。另外,取部分臟器用于病理組織學(xué)檢查。試驗(yàn)結(jié)果表明,鴨感染分離株后不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀,咽喉和泄殖腔未出現(xiàn)排毒現(xiàn)象。鴨感染后第3、5和7d在肺臟、脾臟、肝臟、腦、心臟均可以檢測(cè)到病毒復(fù)制,除肺臟中第3 d病毒含量較高外,其它時(shí)間點(diǎn)的組織中病毒含量均不高。另外,病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),在肺臟中可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),其它組織無明顯的病理變化。以上試驗(yàn)結(jié)果表明分離的H6N6亞型AIV對(duì)鴨的致病力弱,且在鴨體內(nèi)的復(fù)制能力低。3.鴨源H6N6亞型AIV對(duì)免疫器官中細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響:為了解鴨感H6N6亞型AIV后對(duì)免疫器官中IL-2、IL-10和IFN-α轉(zhuǎn)錄水平的影響,本試驗(yàn)通過熒光定量RT-PCR來檢測(cè)鴨感染病毒后免疫器官(胸腺、脾臟、法氏囊)中IL-2、IL-10和IFN-αmRNA表達(dá)動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示,本試驗(yàn)建立的相對(duì)熒光定量RT-PCR方法可以用于檢測(cè)鴨IL-2、IL-10和IFN-αmRNA的轉(zhuǎn)錄水平。鴨感染H6N6后免疫器官中的IL-2、IL-10和IFN-α呈現(xiàn)不同程度的轉(zhuǎn)錄水平變化,不同的細(xì)胞因子在不同組織之間的轉(zhuǎn)錄水平差異較大。其中IL-2在法氏囊中的轉(zhuǎn)錄水平比在胸腺和脾臟中明顯較高;IFN-α在胸腺和脾臟中的轉(zhuǎn)錄水平高于法氏囊;IL-10在免疫器官中轉(zhuǎn)錄水平較低。試驗(yàn)結(jié)果表明H6N6亞型AIV對(duì)鴨免疫器官中IL-2、IL-10和IFN-α轉(zhuǎn)錄水平有一定的影響。綜上所述:本試驗(yàn)分離到一株低致病性H6N6亞型AIV,該病毒可能是由H6N2、H3N6和H5N1等多個(gè)亞型AIV重組而成;鴨感染分離株后無明顯臨床癥狀和病理組織學(xué)變化,喉頭和泄殖腔不存在排毒現(xiàn)象;分離株對(duì)鴨免疫器官損傷輕微,并且對(duì)免疫器官中IL-2、IL-10和IFN-α轉(zhuǎn)錄水平有影響。
【關(guān)鍵詞】：鴨 禽流感病毒 H6N6 基因組測(cè)序 致病性
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文縮略表10-11
• 文獻(xiàn)綜述 H6亞型禽流感病毒研究進(jìn)展11-21
• 第一章 鴨源H6N6亞型AIV分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析21-53
• 1 材料21-22
• 1.1 主要?jiǎng)游?/span>21
• 1.2 主要試劑21-22
• 1.3 主要儀器22
• 2 方法22-28
• 2.1 病毒分離22
• 2.2 血清學(xué)鑒定22-23
• 2.3 生物學(xué)特性測(cè)定23
• 2.4 引物設(shè)計(jì)23-24
• 2.5 全基因組RT-PCR的擴(kuò)增24-26
• 2.6 分離株全基因克隆及重組質(zhì)粒的鑒定26-28
• 2.7 分離株H6N6亞型AIV全基因組核苷酸序列測(cè)定及序列分析28
• 3 結(jié)果28-50
• 3.1 病毒的血清學(xué)鑒定結(jié)果28-29
• 3.2 病毒的RT-PCR鑒定結(jié)果29-31
• 3.3 病毒生物學(xué)特性的測(cè)定31-32
• 3.4 病毒全基因組測(cè)序結(jié)果及同源性比對(duì)結(jié)果32-33
• 3.5 編碼氨基酸序列分析比較結(jié)果33-41
• 3.6 核苷酸序列同源性比對(duì)結(jié)果41-46
• 3.7 遺傳進(jìn)化分析46-50
• 4 討論50-53
• 4.1 關(guān)于AIV分離鑒定方法50-51
• 4.2 關(guān)于家禽在AIV傳播中的作用51
• 4.3 H6亞型AIV的遺傳變異情況51-53
• 第二章 鴨源H6N6亞型AIV對(duì)鴨的致病性研究53-65
• 1 材料53-54
• 1.1 主要毒株53
• 1.2 主要?jiǎng)游?/span>53
• 1.3 主要試劑53-54
• 1.4 主要儀器54
• 2 方法54-58
• 2.1 鴨的致病性試驗(yàn)54-55
• 2.2 H6亞型AIV M基因熒光定量檢測(cè)方法的建立55-56
• 2.3 鴨喉頭、泄殖腔和組織器官中的病毒含量檢測(cè)56-57
• 2.4 H6亞型AIV感染鴨組織臟器的病理觀察57-58
• 3 結(jié)果58-62
• 3.1 H6N6亞型AIV M基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定58-59
• 3.2 H6亞型AIV M基因?qū)崟r(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法建立59-61
• 3.3 鴨感染H6N6亞型AIV后排毒及在組織器官病毒分布情況61
• 3.4 鴨感染H6N6亞型AIV后病理組織學(xué)觀察61-62
• 4 討論62-65
• 4.1 關(guān)于H6N6亞型AIV的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的討論62-63
• 4.2 關(guān)于H6亞型AIV的致病性的研究63-65
• 第三章 H6N6亞型AIV對(duì)鴨免疫器官中細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響65-82
• 1 材料65-66
• 1.1 組織病料65-66
• 1.2 主要試劑66
• 1.3 主要儀器66
• 2 方法66-68
• 2.1 鴨IL-2、IL-10、IFN-α 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建66-67
• 2.2 鴨IL-2、IL-10、IFN-α 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立67-68
• 2.3 H6N6亞型AIV感染鴨后免疫器官中IL-2、IL-10、IFN-α轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)68
• 3 結(jié)果68-79
• 3.1 鴨IL-2、IL-10、IFN-α RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果68-73
• 3.2 鴨IL-2、IL-10、IFN-α的測(cè)定結(jié)果73-74
• 3.3 鴨IL-2、IL-10、IFN-α實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立74-77
• 3.4 H6N6亞型AIV感染后鴨免疫器官中IL-2、IL-10、IFN-α轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)77-79
• 4 討論79-82
• 4.1 關(guān)于細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)熒光定量RT-PCR檢測(cè)79
• 4.2 關(guān)于細(xì)胞因子在抗流感病毒感染中的作用79-80
• 4.3 關(guān)于禽流感病毒感染后對(duì)宿主細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響80-82
• 全文結(jié)論82-83
• 致謝83-84
• 參考文獻(xiàn)84-92
• 附錄一、發(fā)表文章92-93
• 附錄二、各種培養(yǎng)基、溶液及試劑的配制93-94
• 附圖94-95

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本文編號(hào)：970522