本文關(guān)鍵詞：小尾寒羊三個(gè)慢型骨骼肌肌鈣蛋白的基因克隆、結(jié)構(gòu)特征及組織表達(dá)分析

  更多相關(guān)文章： 小尾寒羊 杜泊羊 cTnC蛋白 ssTn I蛋白 ssTnT蛋白 組織表達(dá)

【摘要】：慢型骨骼肌肌鈣蛋白基因主要包括肌鈣蛋白C 1基因(Troponin C type 1,TNNC1)、肌鈣蛋白I 1基因(Troponin I type 1,TNNI1)和肌鈣蛋白T 1基因(Troponin T type 1,TNNT1),它們對(duì)骨骼肌的收縮、骨骼肌肌肉纖維特性及多種疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。目前,有關(guān)綿羊的TNNC1、TNNI1和TNNT1基因的全長(zhǎng)核酸序列未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用RT-PCR、RACE、生物信息學(xué)分析、熒光定量PCR等技術(shù)方法,克隆了小尾寒羊TNNC1、TNNI1和TNNT1基因的全長(zhǎng)序列,預(yù)測(cè)分析了其對(duì)應(yīng)蛋白的序列和特性,構(gòu)建了其在小尾寒羊和杜泊羊多種組織的表達(dá)譜,從分子水平上探索了小尾寒羊三個(gè)基因的主要結(jié)構(gòu)和表達(dá)特性。主要結(jié)果如下:(1)克隆測(cè)序得到了小尾寒羊TNNC1、TNNI1和TNNT1基因的cDNA序列,其中TNNI1包含兩個(gè)5′端有區(qū)別的序列,并分別命名為TNNI1a和TNNI1b。得到的TNNC1、TNNI1a和TNNT1基因的全長(zhǎng)cDNA序列及TNNI1b基因的部分cDNA序列已提交至GenBank,并分別獲得登錄號(hào)為KR153938、KT218688、KT218689及KT218690。相應(yīng)的編碼氨基酸長(zhǎng)度分別為161、187、194和263個(gè)氨基酸。(2)cTnC蛋白為偏酸性蛋白,且結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定,親水性比較好,流動(dòng)性比較大;ssTnI蛋白兩種亞型均為偏堿性蛋白,且結(jié)構(gòu)相對(duì)不穩(wěn)定,親水性比較好;ssTnT蛋白為偏酸性蛋白,流動(dòng)性一般,結(jié)構(gòu)不是很穩(wěn)定,但親水性比較好,流動(dòng)性比較大。cTnC、ssTnI和ssTnT蛋白均沒有跨膜結(jié)構(gòu)域,含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn),無(wú)任何N-糖基化位點(diǎn),預(yù)測(cè)為非分泌性蛋白質(zhì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主。(3)多物種氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示:cTnC蛋白的氨基酸序列在本試驗(yàn)分析的物種中高度保守。ssTnI兩亞型蛋白和ssTnT蛋白的氨基酸序列均與試驗(yàn)中其它哺乳動(dòng)物的保守性比較高,而與試驗(yàn)中其它的非哺乳動(dòng)物的保守性相對(duì)較差。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示:綿羊的cTnC蛋白最先與野豬、家牛和山羊聚到一類;綿羊的ssTnI蛋白最先與山羊和家牛聚到一類;綿羊的ssTnT蛋白最先與野豬和家牛聚到一類。上述結(jié)果表明小尾寒羊中的cTnC、ssTn I和ssTnT蛋白均與試驗(yàn)中的其它哺乳動(dòng)物的關(guān)系比較近。(4)TNNC1、TNNI1和TNNT1基因在小尾寒羊和杜泊羊的多種組織中的表達(dá)情況不同,然而,這幾個(gè)基因的表達(dá)模式卻存在一定的共性。TNNC1、TNNI1和TNNT1基因均在肋間肌、股二頭肌和背最長(zhǎng)肌中高表達(dá),且其表達(dá)量均為肋間肌股二頭肌背最長(zhǎng)肌。小尾寒羊和杜泊羊中TNNI1a基因在每個(gè)組織中的表達(dá)量都高于TNNI1b基因在各組織中的表達(dá)量。此外,TNNC1、TNNI1和TNNT1基因在小尾寒羊和杜泊羊兩品種羊中的表達(dá)量也存在明顯的區(qū)別。特別的,TNNI1a在小尾寒羊肋間肌中的表達(dá)量顯著高于其在杜泊羊中的表達(dá)量(p0.05)。三個(gè)基因?qū)?yīng)的蛋白均在背最長(zhǎng)肌、肋間肌、股二頭肌中存在表達(dá),此外,在兩品種羊的心肌中,cTnC蛋白也存在表達(dá),而ssTn I和ssTnT蛋白則不存在表達(dá)。綜上所述,本試驗(yàn)成功克隆了小尾寒羊的TNNC1、TNNI1和TNNT1基因,并對(duì)其展開了較為系統(tǒng)的研究。從分子水平探索上述基因的特性及功能,為后續(xù)基因功能的研究和分子育種提供基本的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：小尾寒羊 杜泊羊 cTnC蛋白 ssTn I蛋白 ssTnT蛋白 組織表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S826
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-24
• 1.1 小尾寒羊和杜泊羊11-12
• 1.1.1 小尾寒羊11-12
• 1.1.2 杜泊羊12
• 1.2 肌鈣蛋白家族的研究進(jìn)展12-18
• 1.2.1 TnC蛋白14-15
• 1.2.2 TnI蛋白15-17
• 1.2.3 TnT蛋白17-18
• 1.3 慢肌型肌鈣蛋白基因研究進(jìn)展18-21
• 1.3.1 TNNC118-19
• 1.3.2 TNNI119-20
• 1.3.3 TNNT120-21
• 1.4 肌鈣蛋白互作關(guān)系21-23
• 1.4.1 TnC蛋白的互作關(guān)系21-22
• 1.4.2 TnI蛋白的互作關(guān)系22
• 1.4.3 TnT蛋白的互作關(guān)系22-23
• 1.5 本研究目的意義23-24
• 2 材料與方法24-40
• 2.1 試驗(yàn)材料24-26
• 2.1.1 試驗(yàn)組織樣品的采集24
• 2.1.2 試驗(yàn)儀器設(shè)備24-25
• 2.1.3 試驗(yàn)試劑25
• 2.1.4 配制常用試劑25-26
• 2.2 試驗(yàn)方法26-40
• 2.2.1 綿羊各組織總RNA的提取26-27
• 2.2.2 cDNA的合成27-28
• 2.2.3 目的基因選擇及引物設(shè)計(jì)28-29
• 2.2.4 小尾寒羊TNNC1、TNNI1和TNNT1基因的克隆29-35
• 2.2.5 基因及編碼的蛋白序列的特征分析35-36
• 2.2.6 基因TNNC1、TNNI1及TNNT1的熒光定量PCR分析36-37
• 2.2.7 蛋白免疫印跡分析37-40
• 3 結(jié)果與分析40-70
• 3.1 基因全長(zhǎng)cDNA克隆結(jié)果及其序列特征40-43
• 3.1.1 TNNC1基因克隆結(jié)果及其序列特征40-41
• 3.1.2 TNNI1基因克隆結(jié)果及序列特征41-42
• 3.1.3 TNNT1基因克隆結(jié)果及序列特征42-43
• 3.2 蛋白質(zhì)序列分析43-61
• 3.2.1 蛋白質(zhì)一級(jí)序列分析43-46
• 3.2.2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及超二級(jí)結(jié)構(gòu)分析46-52
• 3.2.3 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)52-55
• 3.2.4 蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析55-61
• 3.3 小尾寒羊和杜泊羊TNNC1、TNNI1和TNNT1基因mRNA組織表達(dá)61-70
• 3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線分析61-62
• 3.3.2 小尾寒羊和杜泊羊TNNC1、TNNI1和TNNT1基因mRNA組織表達(dá)62-66
• 3.3.3 小尾寒羊和杜泊羊cTnC、ssTn I和ssTnT蛋白組織表達(dá)66-70
• 4 討論70-74
• 4.1 cTnC、ssTn I和ssTnT蛋白的結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系70-72
• 4.2 cTnC、ssTn I和ssTnT蛋白氨基酸序列同源性及其進(jìn)化分析72
• 4.3 TNNC1、TNNI1和TNNT1基因mRNA表達(dá)分析72-73
• 4.4 cTnC、ssTn I和ssTnT蛋白表達(dá)分析73-74
• 5 結(jié)論74-75
• 參考文獻(xiàn)75-84
• 致謝84-85
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況85

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：966501