發(fā)布時(shí)間：2017-10-03 13:36

  本文關(guān)鍵詞：表面展示柔嫩艾美耳球蟲(chóng)EtMIC2蛋白重組乳酸菌的構(gòu)建及免疫保護(hù)效果研究

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【摘要】：雞球蟲(chóng)病是由一種或多種艾美耳球蟲(chóng)寄生于腸上皮細(xì)胞內(nèi)所引起的原蟲(chóng)病,嚴(yán)重阻礙養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展。目前,雞球蟲(chóng)病的防治主要以化學(xué)藥物為主,但長(zhǎng)期的藥物防治造成耐藥蟲(chóng)株產(chǎn)生和藥物殘留問(wèn)題。因此,采用免疫防治方法已經(jīng)達(dá)到共識(shí)。但現(xiàn)有的市售雞球蟲(chóng)活疫苗存在毒力返強(qiáng)并造成大范圍感染的隱患�；钶d體疫苗能夠使抗原對(duì)機(jī)體的黏膜刺激作用接近自然途徑,其中乳酸菌作為蛋白載體因其具有易于培養(yǎng)、定殖力強(qiáng)、免疫佐劑作用、提取方法簡(jiǎn)單等諸多優(yōu)點(diǎn)成為研制活載體疫苗的熱點(diǎn)。同時(shí),隨著微生物表面展示系統(tǒng)研究的不斷深入使得外源保護(hù)性抗原蛋白可以表達(dá)在菌體表面以便更好的持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)外源蛋白的抗體,誘導(dǎo)相關(guān)免疫機(jī)制的產(chǎn)生。據(jù)研究表明聚-γ-谷氨酸合成酶A(Poly-γ-Glutamic Acid Synthetase A,pgsA)表面展示元件在將外源蛋白表達(dá)在乳酸菌表面上具有良好的效果,使得保護(hù)性抗原與細(xì)胞接觸更接近自然感染狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建具有表面展示作用的重組乳酸菌將柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria tenella)的保護(hù)性抗原微線(xiàn)體蛋白2(EtMIC2)表達(dá)在菌體表面對(duì)雛雞進(jìn)行免疫以期獲得良好的抗E.tenella效果。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.EtMIC2蛋白重組乳酸菌的構(gòu)建及目的蛋白表達(dá)首先應(yīng)用基因工程技術(shù)獲得EtMIC2蛋白基因后與pSIP409-pgsA載體相連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增,酶切驗(yàn)證及測(cè)序結(jié)果正確后通過(guò)電轉(zhuǎn)化法將重組pSIP409-pgsAEtMIC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物乳桿菌NC8中,酶切及測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證后表明成功構(gòu)建pSIP409-pgsAEtMIC2重組乳酸菌;后通過(guò)Western Blot驗(yàn)證蛋白表達(dá),結(jié)果表明蛋白大小為90KDa與預(yù)期結(jié)果一致。并通過(guò)免疫熒光和流式細(xì)胞儀鑒定了目的蛋白的表面展示情況,結(jié)果表明目的蛋白能夠良好的表達(dá)在菌體表面,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)量為26.4%。2.重組菌對(duì)感染E.tenella雛雞免疫水平的影響及免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)以1~25日齡雄性肉雛雞為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,選取植物乳桿菌NC8,pSIP409-pgsA重組乳酸菌及PBS組作為對(duì)照。將同批體重相似且健康的125只1日齡肉用雛雞隨機(jī)分為A、B、C、D、E 5組,每組25只分別飼養(yǎng)于無(wú)自然感染途徑的動(dòng)物室內(nèi)。雛雞1~15日齡期間,A、B兩組每隔1日飼喂前灌服PBS 200μL/只,C、D、E三組每隔1日灌服各自相應(yīng)菌種2×108CFU/200μL,其中C組灌服重組菌pSIP409-pgsA-EtMIC2,D組灌服pSIP409-pgsA重組菌,E組灌服植物乳桿菌NC8。雛雞15日齡時(shí),每組處死10只進(jìn)行外周血中淋巴細(xì)胞增殖能力、CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T淋巴細(xì)胞含量的檢測(cè)、抗體IgG含量及食糜中SIgA含量及細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ分泌量的檢測(cè)。除A組外其它各組余下雛雞分別于15日齡經(jīng)口接種已孢子化的E.tenella卵囊5×104個(gè)/只,攻蟲(chóng)10天后,于25日齡處死全部雛雞,除檢測(cè)上述指標(biāo)外,對(duì)雞只的相對(duì)增重率、盲腸病變記分以及盲腸內(nèi)容物的卵囊值、OPG、等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),對(duì)病理切片進(jìn)行觀(guān)察分析,計(jì)算出抗球蟲(chóng)指數(shù)。(1)重組菌對(duì)感染E.tenella雛雞免疫水平的影響:球蟲(chóng)感染前、后雛雞15日齡和25日齡分別對(duì)各組雛雞進(jìn)行免疫指標(biāo)檢測(cè),結(jié)果表明,服用各自相應(yīng)乳酸菌后感染前、后均能夠提高雛雞外周血中淋巴細(xì)胞的增殖能力,其中pSIP409-pgsA-EtMIC2重組乳酸菌組(C組)與對(duì)照組(A組)、蟲(chóng)組(B組)兩組相比差異顯著(P0.05)。同時(shí)乳酸菌在球蟲(chóng)感染前后均能夠促進(jìn)外周血中CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T淋巴細(xì)胞的生成,其中C組與A、B、D三組相比差異顯著(P0.05)。此外乳酸菌在球蟲(chóng)感染前后能夠提高外周血中細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量,且能夠通過(guò)提高外周血中IgG抗體及腸內(nèi)容物中SIgA抗體的分泌量提高雛雞的體液免疫水平。其中pSIP409-pgsA-EtMIC2重組乳酸菌組效果最佳,植物乳桿菌NC8組和pSIP409-pgsA重組乳酸菌組差異不顯著(P0.05)。(2)重組菌對(duì)雞E.tenella的免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià):結(jié)果表明,在球蟲(chóng)感染前、后,灌服乳酸菌的3組雛雞其平均增重均比B組高,且pSIP409-pgsA-EtMIC2重組乳酸菌組(C組)和蟲(chóng)組(B組)相比差異顯著(P㩳0.05);C、D、E三組灌服乳酸菌組的雛雞其盲腸病變記分均低于未灌服乳酸菌的蟲(chóng)組雞只(B組),且C組最低;B組雛雞盲腸病變最嚴(yán)重,盲腸病變記分平均值達(dá)到3.75,顯著高于其它乳酸菌組(P㩳0.05);灌服乳酸菌的C、D、E三組雛雞其卵囊排出量均低于B組,且pSIP409-pgsA-EtMIC2重組乳酸菌組(C組)最低;灌服乳酸菌的C、D、E三組雛雞其抗球蟲(chóng)指數(shù)分別為145.15、115.57、126.81,C組在120~160之間,表明其具有中等的抗球蟲(chóng)效果。證明了pSIP409-pgsA-EtMIC2重組乳酸菌對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)具有一定的保護(hù)作用,為雞球蟲(chóng)病的免疫防治提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：雞球蟲(chóng)病 重組乳酸菌 EtMIC2 pgsA 免疫保護(hù)效果
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S858.31
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-12
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述12-19
• 第一章 雞球蟲(chóng)的種類(lèi)和免疫防治12-16
• 1.1 雞球蟲(chóng)種類(lèi)及生活史12
• 1.2 雞球蟲(chóng)病的相關(guān)免疫機(jī)制12-13
• 1.3 雞球蟲(chóng)病的免疫防治進(jìn)展13-14
• 1.4 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Et MIC2蛋白應(yīng)用研究進(jìn)展14-15
• 1.5 結(jié)語(yǔ)15-16
• 第二章 乳酸菌的作用及其表面展示系統(tǒng)pgs A研究進(jìn)展16-19
• 2.1 乳酸菌益生作用16
• 2.2 乳酸菌免疫調(diào)節(jié)作用16-17
• 2.3 乳酸菌抗球蟲(chóng)作用17
• 2.4 乳酸菌表面展示元件pgs A17-18
• 2.5 結(jié)語(yǔ)18-19
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容19-56
• 第一章 重組質(zhì)粒p SIP409-pgs A- Et MIC2的構(gòu)建及其在乳酸菌中的表達(dá)19-34
• 1. 材料和方法19-27
• 2. 結(jié)果27-33
• 3. 討論33
• 4. 小結(jié)33-34
• 第二章 pSIP409-pgs A- Et MIC2重組乳酸菌抗E.tenella免疫保護(hù)效果檢測(cè)34-56
• 2.1. 材料和方法34-40
• 2.2. 結(jié)果40-54
• 2.3. 討論54-55
• 2.4. 小結(jié)55-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 附錄63-64
• 作者簡(jiǎn)介64-65
• 致謝65

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本文編號(hào)：965517