本文關(guān)鍵詞：表面展示柔嫩艾美耳球蟲EtMIC2蛋白重組乳酸菌的構(gòu)建及免疫保護(hù)效果研究

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【摘要】：雞球蟲病是由一種或多種艾美耳球蟲寄生于腸上皮細(xì)胞內(nèi)所引起的原蟲病,嚴(yán)重阻礙養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展。目前,雞球蟲病的防治主要以化學(xué)藥物為主,但長期的藥物防治造成耐藥蟲株產(chǎn)生和藥物殘留問題。因此,采用免疫防治方法已經(jīng)達(dá)到共識。但現(xiàn)有的市售雞球蟲活疫苗存在毒力返強(qiáng)并造成大范圍感染的隱患。活載體疫苗能夠使抗原對機(jī)體的黏膜刺激作用接近自然途徑,其中乳酸菌作為蛋白載體因其具有易于培養(yǎng)、定殖力強(qiáng)、免疫佐劑作用、提取方法簡單等諸多優(yōu)點(diǎn)成為研制活載體疫苗的熱點(diǎn)。同時,隨著微生物表面展示系統(tǒng)研究的不斷深入使得外源保護(hù)性抗原蛋白可以表達(dá)在菌體表面以便更好的持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生針對外源蛋白的抗體,誘導(dǎo)相關(guān)免疫機(jī)制的產(chǎn)生。據(jù)研究表明聚-γ-谷氨酸合成酶A(Poly-γ-Glutamic Acid Synthetase A,pgsA)表面展示元件在將外源蛋白表達(dá)在乳酸菌表面上具有良好的效果,使得保護(hù)性抗原與細(xì)胞接觸更接近自然感染狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建具有表面展示作用的重組乳酸菌將柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)的保護(hù)性抗原微線體蛋白2(EtMIC2)表達(dá)在菌體表面對雛雞進(jìn)行免疫以期獲得良好的抗E.tenella效果。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.EtMIC2蛋白重組乳酸菌的構(gòu)建及目的蛋白表達(dá)首先應(yīng)用基因工程技術(shù)獲得EtMIC2蛋白基因后與pSIP409-pgsA載體相連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增,酶切驗(yàn)證及測序結(jié)果正確后通過電轉(zhuǎn)化法將重組pSIP409-pgsAEtMIC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物乳桿菌NC8中,酶切及測序結(jié)果驗(yàn)證后表明成功構(gòu)建pSIP409-pgsAEtMIC2重組乳酸菌;后通過Western Blot驗(yàn)證蛋白表達(dá),結(jié)果表明蛋白大小為90KDa與預(yù)期結(jié)果一致。并通過免疫熒光和流式細(xì)胞儀鑒定了目的蛋白的表面展示情況,結(jié)果表明目的蛋白能夠良好的表達(dá)在菌體表面,流式細(xì)胞術(shù)檢測其相對表達(dá)量為26.4%。2.重組菌對感染E.tenella雛雞免疫水平的影響及免疫保護(hù)效果評價動物保護(hù)性試驗(yàn)以1~25日齡雄性肉雛雞為實(shí)驗(yàn)動物,選取植物乳桿菌NC8,pSIP409-pgsA重組乳酸菌及PBS組作為對照。將同批體重相似且健康的125只1日齡肉用雛雞隨機(jī)分為A、B、C、D、E 5組,每組25只分別飼養(yǎng)于無自然感染途徑的動物室內(nèi)。雛雞1~15日齡期間,A、B兩組每隔1日飼喂前灌服PBS 200μL/只,C、D、E三組每隔1日灌服各自相應(yīng)菌種2×108CFU/200μL,其中C組灌服重組菌pSIP409-pgsA-EtMIC2,D組灌服pSIP409-pgsA重組菌,E組灌服植物乳桿菌NC8。雛雞15日齡時,每組處死10只進(jìn)行外周血中淋巴細(xì)胞增殖能力、CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T淋巴細(xì)胞含量的檢測、抗體IgG含量及食糜中SIgA含量及細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ分泌量的檢測。除A組外其它各組余下雛雞分別于15日齡經(jīng)口接種已孢子化的E.tenella卵囊5×104個/只,攻蟲10天后,于25日齡處死全部雛雞,除檢測上述指標(biāo)外,對雞只的相對增重率、盲腸病變記分以及盲腸內(nèi)容物的卵囊值、OPG、等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),對病理切片進(jìn)行觀察分析,計(jì)算出抗球蟲指數(shù)。(1)重組菌對感染E.tenella雛雞免疫水平的影響:球蟲感染前、后雛雞15日齡和25日齡分別對各組雛雞進(jìn)行免疫指標(biāo)檢測,結(jié)果表明,服用各自相應(yīng)乳酸菌后感染前、后均能夠提高雛雞外周血中淋巴細(xì)胞的增殖能力,其中pSIP409-pgsA-EtMIC2重組乳酸菌組(C組)與對照組(A組)、蟲組(B組)兩組相比差異顯著(P0.05)。同時乳酸菌在球蟲感染前后均能夠促進(jìn)外周血中CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T淋巴細(xì)胞的生成,其中C組與A、B、D三組相比差異顯著(P0.05)。此外乳酸菌在球蟲感染前后能夠提高外周血中細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量,且能夠通過提高外周血中IgG抗體及腸內(nèi)容物中SIgA抗體的分泌量提高雛雞的體液免疫水平。其中pSIP409-pgsA-EtMIC2重組乳酸菌組效果最佳,植物乳桿菌NC8組和pSIP409-pgsA重組乳酸菌組差異不顯著(P0.05)。(2)重組菌對雞E.tenella的免疫保護(hù)效果評價:結(jié)果表明,在球蟲感染前、后,灌服乳酸菌的3組雛雞其平均增重均比B組高,且pSIP409-pgsA-EtMIC2重組乳酸菌組(C組)和蟲組(B組)相比差異顯著(P㩳0.05);C、D、E三組灌服乳酸菌組的雛雞其盲腸病變記分均低于未灌服乳酸菌的蟲組雞只(B組),且C組最低;B組雛雞盲腸病變最嚴(yán)重,盲腸病變記分平均值達(dá)到3.75,顯著高于其它乳酸菌組(P㩳0.05);灌服乳酸菌的C、D、E三組雛雞其卵囊排出量均低于B組,且pSIP409-pgsA-EtMIC2重組乳酸菌組(C組)最低;灌服乳酸菌的C、D、E三組雛雞其抗球蟲指數(shù)分別為145.15、115.57、126.81,C組在120~160之間,表明其具有中等的抗球蟲效果。證明了pSIP409-pgsA-EtMIC2重組乳酸菌對柔嫩艾美耳球蟲具有一定的保護(hù)作用,為雞球蟲病的免疫防治提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：雞球蟲病 重組乳酸菌 EtMIC2 pgsA 免疫保護(hù)效果
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-12
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述12-19
• 第一章 雞球蟲的種類和免疫防治12-16
• 1.1 雞球蟲種類及生活史12
• 1.2 雞球蟲病的相關(guān)免疫機(jī)制12-13
• 1.3 雞球蟲病的免疫防治進(jìn)展13-14
• 1.4 柔嫩艾美耳球蟲Et MIC2蛋白應(yīng)用研究進(jìn)展14-15
• 1.5 結(jié)語15-16
• 第二章 乳酸菌的作用及其表面展示系統(tǒng)pgs A研究進(jìn)展16-19
• 2.1 乳酸菌益生作用16
• 2.2 乳酸菌免疫調(diào)節(jié)作用16-17
• 2.3 乳酸菌抗球蟲作用17
• 2.4 乳酸菌表面展示元件pgs A17-18
• 2.5 結(jié)語18-19
• 第二篇 研究內(nèi)容19-56
• 第一章 重組質(zhì)粒p SIP409-pgs A- Et MIC2的構(gòu)建及其在乳酸菌中的表達(dá)19-34
• 1. 材料和方法19-27
• 2. 結(jié)果27-33
• 3. 討論33
• 4. 小結(jié)33-34
• 第二章 pSIP409-pgs A- Et MIC2重組乳酸菌抗E.tenella免疫保護(hù)效果檢測34-56
• 2.1. 材料和方法34-40
• 2.2. 結(jié)果40-54
• 2.3. 討論54-55
• 2.4. 小結(jié)55-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 附錄63-64
• 作者簡介64-65
• 致謝65

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本文編號：965517