本文關(guān)鍵詞：隔孢伏革菌植酸酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)研究

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【摘要】：植酸酶作為在飼料添加劑添加于單胃動(dòng)物飼料中,可提高植物性飼料中磷的利用率和單胃動(dòng)物對(duì)礦質(zhì)元素的吸收率,并減輕動(dòng)物糞便中磷對(duì)環(huán)境的污染,植酸酶的喂養(yǎng)效果已得到了確認(rèn),因此具有極高的應(yīng)用價(jià)值,但植酸酶在天然材料中含量太低,難以獲得大量產(chǎn)品,價(jià)格昂貴；同時(shí)酶的熱穩(wěn)定性難以完全滿足飼料加工的要求。因此,提高植酸酶基因的表達(dá)水平,改善植酸酶的穩(wěn)定性是一個(gè)函待解決的問(wèn)題。本研究按照畢赤酵母對(duì)遺傳密碼子的偏好性,利用重疊PCR方法人工合成6-phyA,將其插入到pPIC9K載體,構(gòu)建成6-phyA整合型畢赤酵母表達(dá)載體,通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入GS115酵母細(xì)胞,并篩選出Mur高拷貝轉(zhuǎn)化子,建立了隔孢伏革菌植酸酶分泌表達(dá)量高的畢赤酵母株。主要結(jié)果如下：1.根據(jù)GenBank隔孢伏革菌植酸酶編碼序列成功合成34條引物,并利用重疊延伸PCR技術(shù)合成了6-PhyA基因。對(duì)合成的植酸酶序列進(jìn)行了畢赤酵母密碼子嗜好性分析,結(jié)果較為理想,經(jīng)軟件分析,其翻譯為氨基酸序列與野生型100%同源。2-通過(guò)對(duì)信號(hào)肽的選擇開(kāi)展研究,試圖通過(guò)6-PhyA本身的信號(hào)肽與儀信號(hào)肽相融合,以促進(jìn)植酸酶的表達(dá),但是效果不理想,通過(guò)用釀酒酵母細(xì)胞研究6-PhyA野生型信號(hào)肽作用,發(fā)現(xiàn)在強(qiáng)啟動(dòng)子GPD的驅(qū)動(dòng)下,未發(fā)現(xiàn)其能介導(dǎo)6-PhyA在釀酒酵母細(xì)胞中的表達(dá),由此證明,野生型信號(hào)肽的存在并不能促進(jìn)植酸酶的表達(dá)。3.將植酸酶基因克隆到表達(dá)載體pPIC9K中,電擊化轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115,獲得重組畢赤酵母工程菌GS115/pPIC9K/L6ph。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)72h后,產(chǎn)酶量達(dá)到最高峰,酶活力達(dá)到23.7U/mL,實(shí)現(xiàn)了植酸酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)。4.對(duì)植酸酶酶學(xué)性質(zhì)的研究表明,SDS-PAGE分析表明表達(dá)植酸酶的分子量為50 kD左右。PhyA植酸酶最適溫度為37-C,最適pH值為5.5,適合單胃動(dòng)物的消化道環(huán)境；在55℃作用60min后,殘余酶活是味保溫處理的樣品活性的44%,超過(guò)55℃保溫處理,酶活急劇下降；金屬離子對(duì)植酸酶的活性沒(méi)有影響。
【關(guān)鍵詞】：植酸酶 PhyA基因 畢赤酵母 信號(hào)肽 高效表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S816.7
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-8
• 符號(hào)說(shuō)明8-9
• 第一章 隔孢伏革菌(Peniophora lycii)的植酸酶基因的合成與克隆9-16
• 1 材料與方法9-12
• 1.1 引物的設(shè)計(jì)9-10
• 1.2 6-磷酸植酸酶(6-PhyA)基因的合成10-11
• 1.3 6-PhyA畢赤酵母密碼子嗜好分析11
• 1.4 PCR產(chǎn)物的克隆11-12
• 2 結(jié)果12-15
• 2.1 L6ph密碼子的畢赤酵母嗜好分析12-14
• 2.2 pUC57/6-PhyA轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒14-15
• 3 本章小結(jié)15-16
• 第二章 含野生型信號(hào)肽6-PhyA基因在畢赤酵母中的表達(dá)研究16-28
• 1 材料與方法16-23
• 1.1 畢赤酵母分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建16-18
• 1.2 畢赤酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化18-21
• 1.3 6ph在畢赤酵母中的表達(dá)21
• 1.4 植酸酶的生物學(xué)性質(zhì)的測(cè)定21-23
• 2 結(jié)果23-27
• 2.1 畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K/6ph的酶切鑒定23-24
• 2.2 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的篩選24-25
• 2.3 6ph在畢赤酵母中表達(dá)25
• 2.4 植酸酶活性的檢測(cè)25-27
• 3 本章小結(jié)27-28
• 第三章 含野生型信號(hào)6ph基因的表達(dá)研究28-38
• 1 材料與方法28-34
• 1.1 GPD驅(qū)動(dòng)的植酸酶酵母表達(dá)載體的構(gòu)建28-32
• 1.2 釀酒酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與鑒定32-33
• 1.3 植酸酶活性的鑒定33-34
• 2 結(jié)果34-37
• 2.1 表達(dá)載體pGPD-6ph-1的構(gòu)建34-35
• 2.2 pGPD-6ph釀酒酵母表達(dá)載體的構(gòu)建35-37
• 2.3 W303-1A/pGPD-6ph細(xì)胞PCR鑒定37
• 2.4 植酸酶的表達(dá)鑒定37
• 3 本章小結(jié)37-38
• 第四章 α信號(hào)肽引導(dǎo)的6ph基因在畢赤酵母中的表達(dá)研究38-44
• 1 材料與方法38-40
• 1.1 無(wú)野生型信號(hào)肽6-磷酸植酸酶基因的PCR擴(kuò)增38
• 1.2 pPIC9K/L6ph的構(gòu)建38-39
• 1.3 pPIC9K/L6ph陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定39
• 1.4 高拷貝L6ph畢赤酵母的建立39
• 1.5 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定39
• 1.6 植酸酶活性的鑒定39-40
• 2 結(jié)果40-43
• 2.1 pPIC9K/L6ph轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒的酶切鑒定40-41
• 2.2 GS115畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定41-42
• 2.3 植酸酶活性的檢測(cè)42-43
• 3 本章小結(jié)43-44
• 第五章 植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究44-48
• 1 材料與方法44-45
• 1.1 時(shí)間對(duì)酶活性的影響44
• 1.2 植酸酶最適反應(yīng)溫度的研究44
• 1.3 植酸酶最適pH的研究44
• 1.4 植酸酶熱穩(wěn)定性的研究44
• 1.5 金屬離子對(duì)酶活性影響的測(cè)定44-45
• 2 結(jié)果45-48
• 2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響45
• 2.2 溫度對(duì)酶活性的影響45-46
• 2.3 植酸酶的最適pH46
• 2.4 植酸酶的熱穩(wěn)定性46-47
• 2.5 金屬離子對(duì)植酸酶的影響47-48
• 第六章 討論48-51
• 1 酵母表達(dá)系統(tǒng)48
• 2 外源性基因在酵母細(xì)胞中的高效表達(dá)48-49
• 3 植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)49-50
• 4 未來(lái)展望50-51
• 參考文獻(xiàn)51-54
• 綜述54-63
• 參考文獻(xiàn)61-63
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文63-64

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3 上海交通大學(xué) 艾曉杰 謝愛(ài)純 金凌艷;如何充分揚(yáng)植酸酶之長(zhǎng)避之短[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2005年

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