本文關鍵詞：旋毛蟲表皮膠原蛋白rol-6在秀麗隱桿線蟲體內的表達

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【摘要】：旋毛蟲(Trichinella spiralis,T.spiralis)表皮膠原蛋白構成的表皮不僅能夠維持蟲體的形態(tài)和運動,還能夠抵抗宿主的防御系統(tǒng),保護蟲體免受外界傷害。隨著人類對馬鈴薯金線蟲、蒼白球胞囊線蟲、血吸蟲等寄生蟲的表皮膠原蛋白進行研究,證明了此類蛋白會引起宿主在免疫過程中最強烈的反應,是宿主免疫系統(tǒng)攻擊的最重要抗原。T.spiralis表皮膠原蛋白在蟲體剛剛蛻皮后,合成速度很快,且每一階段的組分與結構各不相同,但是在蟲體免疫應答的功能上與其他線蟲的表皮膠原蛋白相似,都會引起宿主強烈的免疫反應。近年來,人們對表皮膠原蛋白的研究主要集中在馬鈴薯金線蟲以及血吸蟲,而對T.spiralis表皮膠原蛋白rol-6的研究極少,所以利用秀麗隱桿線蟲(Caenorkabditis elegans,C.elegans)表達rol-6蛋白可以為篩選旋毛蟲疫苗候選抗原奠定基礎。本文根據(jù)NCBI中rol-6(XM_003379120.)編碼序列設計引物,提取T.spiralis總RNA,反轉為cDNA作為模板并進行RT-PCR擴增,將擴增產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體之后轉入克隆感受態(tài)DH5α,經(jīng)過PCR和Bam H1/Sal I雙酶切鑒定后進行測序。結果顯示克隆的序列由1023個核苷酸組成,編碼340個氨基酸。利用生物信息學軟件對序列結構進行分析,結果表明rol-6不僅具備表皮膠原蛋白Gly-X-Y的結構,而且具有潛在的抗原表位。本實驗將rol-6編碼序列克隆至原核表達載體pGEX-6p-1,構建重組質粒pGEX-rol,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后轉入大腸桿菌Tans(DE3)中,以IPTG誘導蛋白表達。SDS-PAGE電泳結果顯示蛋白分子量約為61KD,其中載體中的GST標簽蛋白約為26 KD,rol-6蛋白約為35 KD,結果與預期相符。利用電洗脫方法純化重組蛋白并將其免疫小鼠制備多克隆抗體,經(jīng)western blot檢測,成功獲得鼠抗rol-6血清。為了進一步表達rol-6的活性蛋白,實驗中采用PCR方法從C.elegans基因組DNA中擴增sqt-1 5'端側翼序列(5'-FSsqt-1)作為啟動子,將5'-FSsqt-1、rol-6編碼序列克隆至含有綠色熒光蛋白GFP的啟動子驗證載體pPD95.77,構建重組質粒pPD-FSsqt-rol-GFP,通過顯微注射技術,將質粒注射到C.elegans生殖腺內并培養(yǎng)5~7 d。結果顯示,啟動子5'-FSsqt-1能夠啟動rol-6與GFP融合蛋白在C.elegans體內瞬時表達。T.spiralis與C.elegans都屬于線蟲,具有一定的親緣關系,T.spiralis抗原rol-6能夠在C.elegans體內表達,其選擇性剪接、糖基化修飾以及構象折疊就會更加接近天然抗原,從而使抗原活性增強,且表達過程方便簡單,為研制T.spiralis疫苗提供便利。
【關鍵詞】：旋毛蟲 rol-6蛋白 sqt-1的5'端側翼序列 秀麗隱桿線蟲
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7
【目錄】：

• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-16
• 1.1 旋毛蟲保護性抗原的分類11
• 1.2 表皮膠原蛋白的研究進展11-13
• 1.2.1 表皮膠原蛋白的概述11
• 1.2.2 表皮膠原蛋白的生物合成11-12
• 1.2.3 表皮膠原蛋白的組成12
• 1.2.4 表皮膠原蛋白的結構特征12
• 1.2.5 旋毛蟲表皮膠原蛋白的功能12-13
• 1.3 秀麗隱桿線蟲在寄生性線蟲抗原研究中的應用13-15
• 1.3.1 秀麗隱桿線蟲簡介13-14
• 1.3.2 秀麗隱桿線蟲作為表達系統(tǒng)的優(yōu)勢14
• 1.3.3 利用秀麗隱桿線蟲表達盤尾絲狀線蟲蛋白14
• 1.3.4 利用秀麗隱桿線蟲表達人的馬來布魯絲蟲alt相關抗原14
• 1.3.5 利用秀麗隱桿線蟲表達捻轉血矛線蟲半胱氨酸蛋白酶14-15
• 1.4 研究目的和意義15-16
• 2 材料與方法16-30
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 蟲種和實驗動物16
• 2.1.2 菌株和載體16
• 2.1.3 主要試劑16
• 2.1.4 主要儀器和設備16-17
• 2.1.5 主要軟件及網(wǎng)絡資源17
• 2.2 試驗方法17-30
• 2.2.1 旋毛蟲rol-6 基因的克隆和序列分析17-21
• 2.2.2 重組表達質粒pGEX-rol的構建21-22
• 2.2.3 pGEX-rol（DE3）的誘導表達及條件優(yōu)化22-23
• 2.2.4 重組蛋白純化與Western Blot檢測23
• 2.2.5 重組蛋白多抗制備23-24
• 2.2.6 啟動子sqt-1 的 5'端側翼序列的克隆24-25
• 2.2.7 重組表達質粒pPD-FSsqt-GFP的構建25-26
• 2.2.8 重組表達質粒pPD-rol-GFP的構建26-27
• 2.2.9 重組表達質粒pPD-FSsqt-rol-GFP的構建27-28
• 2.2.10 秀麗隱桿線蟲的顯微注射及熒光觀察28-29
• 2.2.11 秀麗隱桿線蟲表達的rol-6 蛋白Western Blot檢測29-30
• 3 結果30-43
• 3.1 旋毛蟲rol-6 基因克隆結果30-33
• 3.1.1 rol-6 編碼序列擴增結果30
• 3.1.2 重組克隆質粒pMD-rol的鑒定30-31
• 3.1.3 rol-6 基因分析結果31-33
• 3.2 重組表達質粒pGEX-rol的鑒定33
• 3.3 誘導表達結果33-37
• 3.3.1 pGEX-rol重組蛋白的表達鑒定33-34
• 3.3.2 誘導pGEX-rol（DE3）時間的優(yōu)化34
• 3.3.3 誘導pGEX-rol（DE3）IPTG濃度的優(yōu)化34-35
• 3.3.4 誘導pGEX-rol（DE3）溫度的優(yōu)化35
• 3.3.5 重組蛋白的可溶性分析35-36
• 3.3.6 重組蛋白Western Blot檢測結果36
• 3.3.7 重組蛋白多克隆抗體的效價36
• 3.3.8 多克隆抗體Western Blot檢測36-37
• 3.4 啟動子sqt-1 的 5'端側翼序列的克隆37-40
• 3.4.1 sqt-1 的 5'端側翼序列的擴增37
• 3.4.2 重組克隆質粒pMD-FSsqt的鑒定37-38
• 3.4.3 sqt-1 的 5'端側翼序列分析結果38-40
• 3.5 重組表達質粒pPD-FSsqt-GFP的構建40
• 3.6 重組表達質粒pPD-rol-GFP40-41
• 3.7 重組表達質粒pPD-FSsqt-rol-GFP的鑒定41
• 3.8 秀麗隱桿線蟲顯微注射后的熒光觀察41-42
• 3.9 秀麗隱桿線蟲表達的rol-6 蛋白Western Blot檢測結果42-43
• 4 討論43-45
• 4.1 旋毛蟲rol-6 基因的克隆和序列分析43
• 4.2 旋毛蟲rol-6 基因的原核表達及多抗制備43-44
• 4.3 啟動子sqt-1 的 5'端側翼序克隆與啟動活性的驗證44
• 4.4 旋毛蟲rol-6 基因在秀麗隱桿線蟲體內的表達44-45
• 5 結論45-46
• 致謝46-47
• 參考文獻47-51
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文51

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本文編號：959115