本文關(guān)鍵詞：CD163和Sn受體胞外區(qū)功能結(jié)構(gòu)域在PRRSV-ADE中的作用

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【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征疫病是我國重要的傳染病,豬繁殖與呼吸綜合征病毒是該病的致病病毒。該病毒感染后不僅造成豬只的免疫抑制現(xiàn)象,還能夠引發(fā)豬只的持續(xù)性感染。有研究表明FcγR介導的PRRSV-抗體感染性復合物感染巨噬細胞是引起PRRSV持續(xù)性感染的原因之一,然而該作用機制并不十分完善。我們的研究發(fā)現(xiàn)PRRSV-抗體感染性復合物感染巨噬細胞的過程可能和病毒受體也有關(guān)。通過研究CD163分子和Sn受體在PRRSV感染中的ADE作用,為進一步完善抗體介導的PRRSV持續(xù)感染機制,對PRRS新型疫苗的研制具有重要的指導意義。但是當前關(guān)于CD163分子和Sn受體在PRRSV入侵PAM細胞整個過程當中的分子機制以及PRRSV感染過程中ADE機制不是非常了解,PRRSV或者是PRRSV-抗體感染性復合物感染機體的過程也不清楚,也不確定CD163分子和Sn受體功能結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用的具體位置。本試驗將CD163分子胞外區(qū)的九個結(jié)構(gòu)域分為四個片段,即CD163-P1(SRCR1-2),CD163-P2(SRCR3-4),CD163-P3(SRCR5-6)和CD163-P4(SRCR7-9),將Sn受體胞外區(qū)的17個結(jié)構(gòu)域分為9個片段,即Sn1(1~150aa),Sn2(137~228aa),Sn3(236~406aa),Sn4(413~594aa),Sn5(599~791aa),Sn6(796~979aa),Sn7(981~1150aa),Sn8(1170~1248aa),Sn9(1441~1631aa)。用已構(gòu)建好的CD163分子和Sn受體不同片段的結(jié)構(gòu)域重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入表達菌BL21(DE3)中進行原核表達,并用不同濃度的尿素對表達的重組蛋白進行純化。收集PAM細胞,鋪于細胞培養(yǎng)板中,使PAM細胞貼壁,然后用CD163和Sn不同片段的不同稀釋度的結(jié)構(gòu)域重組蛋白與等體積的PRRSV或4倍稀釋的PRRSV-IgG感染性復合物混合作用1h后,再感染PAM細胞,并設(shè)置陰性對照組,實時定量PCR方法檢測PRRSV拷貝數(shù),Graph Pad Prism 5軟件對所得到的數(shù)據(jù)進行處理。本研究首先從PRRSV抗原抗體檢測陰性豬的肺臟中收集PAM細胞,提取細胞總RNA,根據(jù)Sn(Gen Bank:JX070181.1)的基因序列及對Sn胞外區(qū)片段的劃分,分別設(shè)計一對包含Sn6片段和Sn8片段結(jié)構(gòu)域的特異性引物,再用RT-PCR方法擴增出Sn6和Sn8兩個片段結(jié)構(gòu)域基因,長度分別為735 bp和567 bp,并將含有結(jié)構(gòu)域基因的這兩個片段亞克隆到載體PET-32a質(zhì)粒中,成功得到重組表達載體質(zhì)粒PET-Sn6、PET-Sn8。將構(gòu)建好的PET-Sn6和PET-Sn8重組質(zhì)粒和實驗室已經(jīng)保存的PET-CD163-P1,PET-CD163-P2,PET-CD163-P3,PET-CD163-P4,PET-Sn1,PET-Sn2,PET-Sn3,PET-Sn4,PET-Sn5,PET-Sn7和PET-Sn9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達菌BL21(DE3)中,通過最佳IPTG誘導表達的時間和最適誘導表達的濃度,大量表達CD163-P1,CD163-P2,CD163-P3和CD163-P4,Sn1,Sn2,Sn3,Sn4,Sn5,Sn6,Sn7,Sn8和Sn9重組蛋白,并用不同濃度的尿素洗滌純化重組蛋白,然后用紫外分光光度計測定蛋白濃度。為了探索CD163和Sn受體功能結(jié)構(gòu)域在PRRSV感染PAM過程中發(fā)揮什么樣的作用,將試驗一所制備的CD163-P1,CD163-P2,CD163-P3和CD163-P4,Sn1,Sn2,Sn3,Sn4,Sn5,Sn6,Sn7,Sn8和Sn9結(jié)構(gòu)域重組蛋白,分別用不加血清的1640營養(yǎng)液稀釋為2.0mg/m L,1.0mg/m L,0.2mg/m L三個不同的濃度,再分別與等體積的200個TCID50/0.1m L PRRSV病毒充分混勻后放置于37℃培養(yǎng)箱作用1h,再感染PAM細胞孵育1h后,補加營養(yǎng)液作用48h,同時設(shè)置陰性對照組,用已建立的絕對熒光定量PCR方法檢測感染細胞中PRRSV的拷貝數(shù),并用Graph Pad Prism 5軟件對所得到的數(shù)據(jù)進行處理。由試驗結(jié)果可以看出,與PRRSV單純感染PAM細胞組相比,CD163和Sn各片段不同稀釋度的結(jié)構(gòu)域重組蛋白與PRRSV混合作用感染48h后,PRRSV的拷貝數(shù)均明顯低于對照組PRRSV的拷貝數(shù),說明CD163和Sn各片段不同稀釋度的結(jié)構(gòu)域重組蛋白與PAM細胞上的CD163和Sn受體存在競爭與PRRSV結(jié)合的作用,并且重組蛋白濃度越高,競爭抑制作用越明顯。在CD163各片段不同稀釋度的結(jié)構(gòu)域蛋白中,2.0mg/m L濃度的各片段蛋白中CD163-P1的抑制作用較明顯,1.0mg/m L濃度的各片段蛋白中CD163-P3的抑制作用較明顯,0.2mg/m L濃度的各片段蛋白中CD163-P2和CD163-P4的抑制作用較明顯,但各個濃度總體之間的規(guī)律不太明顯。在Sn各片段不同稀釋度的結(jié)構(gòu)域蛋白中,Sn6和Sn8片段各個濃度的結(jié)構(gòu)域重組蛋白的競爭抑制作用相比其它片段更明顯,表明Sn6和Sn8片段結(jié)構(gòu)域可能在參與PRRSV感染PAM細胞中發(fā)揮主要作用,本試驗為進一步研究CD163分子和Sn受體胞外區(qū)功能結(jié)構(gòu)域在PRRSV感染PAM細胞的分子機制及PRRSV-ADE作用機制提供了一些參考依據(jù)。在此基礎(chǔ)上,取2倍稀釋的豬PRRSV特異性IgG 0.05m L與等體積的200個TCID50/0.1m L PRRSV(使用之前先用無血清的1640營養(yǎng)液稀釋2.5倍)病毒充分混勻后,再取試驗一所制備的CD163-P1,CD163-P2,CD163-P3和CD163-P4,Sn1,Sn2,Sn3,Sn4,Sn5,Sn6,Sn7,Sn8和Sn9結(jié)構(gòu)域重組蛋白,并分別用不加血清的1640營養(yǎng)液稀釋為2.0mg/m L,1.0mg/m L,0.2mg/m L三個不同的濃度,然后分別取各個不同濃度的重組蛋白0.1m L,充分混勻后放置于37℃培養(yǎng)箱作用1h,再感染PAM細胞孵育1h后,補加營養(yǎng)液作用48h,同時設(shè)置陰性對照組,用已建立的絕對熒光定量PCR方法檢測感染細胞中PRRSV的拷貝數(shù),并用Graph Pad Prism 5軟件對所得到的數(shù)據(jù)進行處理。由試驗結(jié)果可以看出,與單純PRRSV-IgG感染PAM細胞對照組相比,高濃度的CD163各片段的結(jié)構(gòu)域重組蛋白與PAM細胞上的CD163受體存在競爭與PRRSV結(jié)合的作用,在PRRSV-IgG感染PAM細胞的過程中抑制PRRSV的增殖,且濃度越高抑制作用越明顯;而低濃度的CD163各片段的結(jié)構(gòu)域重組蛋白與PRRSV-IgG作用一段時間后感染PAM細胞,發(fā)現(xiàn)PRRSV的拷貝數(shù)顯著升高,結(jié)果表明CD163-P1,CD163-P2,CD163-P3和CD163-P4各片段結(jié)構(gòu)域在PRRSV感染中的ADE作用規(guī)律并不明顯。與單純PRRSV-IgG感染PAM細胞對照組相比,高濃度的Sn各片段結(jié)構(gòu)域蛋白對PRRSV-IgG侵入PAM后的增殖具有顯著的抑制作用,且濃度越高抑制作用越明顯;而低濃度的Sn各片段結(jié)構(gòu)域蛋白中,Sn6和Sn8結(jié)構(gòu)域蛋白與PRRSV-IgG混合作用一段時間后,PRRSV的增殖被抑制,而其他蛋白作用的PRRSV拷貝數(shù)有所上升,間接說明了Sn6和Sn8片段結(jié)構(gòu)域參與了PRRSV感染的ADE作用,且Sn6和Sn8片段結(jié)構(gòu)域同時作用時的ADE作用較明顯。表明Sn6和Sn8片段結(jié)構(gòu)域能夠影響PRRSV-IgG在細胞內(nèi)的復制增殖,暗示Sn6和Sn8片段結(jié)構(gòu)域可能參與免疫復合物在細胞內(nèi)的增殖,而且發(fā)揮主要功能作用。本研究進一步探討了CD163分子和Sn受體胞外區(qū)功能結(jié)構(gòu)域在PRRSV感染中的抗體依賴性增強作用,為深入研究PRRSV-抗體感染性復合物入侵宿主細胞的分子機制提供了理論依據(jù),對PRRS新型疫苗的研制及抗病毒藥物的篩選具有重要的指導意義。
【關(guān)鍵詞】：PRRSV 重組蛋白 PRRSV-IgG CD163 Sn 抗體依賴性增強作用
【學位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 致謝4-6
• 中文摘要6-9
• 英文縮略詞9-10
• 文獻綜述10-23
• 引言23-24
• 試驗一 CD163和Sn胞外區(qū)功能結(jié)構(gòu)域重組蛋白的制備24-36
• 1. 材料24-25
• 2. 方法25-31
• 3. 結(jié)果與分析31-35
• 4. 討論35-36
• 試驗二 CD163和Sn受體胞外區(qū)功能結(jié)構(gòu)域在PRRSV感染PAM細胞中的作用36-43
• 1. 材料36-37
• 2. 方法37-38
• 3. 結(jié)果與分析38-42
• 4. 討論42-43
• 試驗三 CD163和Sn受體胞外區(qū)功能結(jié)構(gòu)域在PRRSV-ADE感染中的作用43-51
• 1. 材料43-44
• 2. 方法44-45
• 3. 結(jié)果與分析45-49
• 4. 討論49-51
• 全文總結(jié)51-52
• 參考文獻52-60
• 發(fā)表文章60-61
• ABSTRACT61-64

【參考文獻】

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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本文編號：957566