本文關鍵詞：結核分枝桿菌孤兒反應調節(jié)因子Rv0818基因缺失株的構建及功能的初步研究

  更多相關文章： 結核分枝桿菌 孤兒反應調節(jié)因子 Rv0818 GlnR 基因缺失 NO耐受

【摘要】：結核分枝桿菌在巨噬細胞中生存需要面對多種極端的環(huán)境,如缺氧、一氧化氮殺傷、營養(yǎng)缺乏等等。雙組份調節(jié)系統(tǒng)對于結核分桿菌在這些極端環(huán)境中存活至關重要。目前對于雙組份調控系統(tǒng)孤兒反應調節(jié)因子Rv0818的功能及上游信號研究較少。本實驗利用溫敏性噬菌體介導的結核分枝桿菌敲除方法構建了Rv0818單基因缺失株。通過比較缺失株與野生株在固體平板上形態(tài)學特征、對于一氧化氮的耐受以及在巨噬細胞中的存活情況,觀察Rv0818缺失對結核分枝桿菌的影響。并通過檢測Rv0818下游基因表達量變化,驗證了Rv0818作為轉錄調控因子的作用。本實驗為結核病致病機理的研究提供了實驗基礎,同時給結核疫苗的研制提供了備選的基因缺失菌株。1結核分枝桿菌基因缺失株的構建與鑒定實驗成功將Rv0818同源重組區(qū)域插入到分枝桿菌噬菌體中,并利用噬菌體感染結核分枝桿菌得到了能在Hyg抗性平板上生長的陽性克隆子。通過PCR鑒定和測序鑒定確定了目的基因被抗性區(qū)域替換,成功構建了結核分枝桿菌基因缺失株。2形態(tài)學特性比較實驗比較了野生株與突變株在固體平板上的形態(tài)學特征。結果顯示缺失株在固體平板上生長形成更少的索狀結構,而索狀結構的形成與菌株的個體大小、生長速率以及細胞壁外層結構密切相關,預示著Rv0818缺失株毒力的減弱。3 NO耐受能力的比較實驗比較了野生株和缺失株在NO刺激條件下的生長情況。結果顯示野生株與缺失株的生長會受到高濃度NO的抑制。而野生株能夠更快從NO抑制作用中恢復,說明Rv0818的缺失影響了菌株對環(huán)境的適應能力。4胞內存活能力的比較實驗比較了巨噬細胞對野生株與突變株的吞噬率,結果顯示缺失株更容易被巨噬細胞吞噬。實驗還比較了菌株在感染細胞后24h、48h、72h的存活情況。結果顯示缺失株在胞內活菌數(shù)基本不變,而野生株活菌數(shù)在感染72h時增加了3倍,說明Rv0818的缺失使菌株在胞內的存活能力下降。5 Rv0818下游基因表達量變化實驗比較了Rv0818缺失時部分基因表達量的變化。結果顯示Rv0818缺失后,NO耐受相關基因的表達量顯著上升,同時代謝相關基因表達量顯著下調,驗證了Rv0818對這些基因的調節(jié)作用。6兔抗Rv0818多克隆抗體的制備實驗制備了兔抗Rv0818多克隆抗體,并通過Western Blot驗證了其使用效果,結果顯示該抗體可以用于Rv0818后續(xù)功能的研究。
【關鍵詞】：結核分枝桿菌 孤兒反應調節(jié)因子 Rv0818 GlnR 基因缺失 NO耐受
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.618
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 縮略表9-10
• 1 前言10-17
• 1.1 結核病現(xiàn)狀10-11
• 1.2 結核分枝桿菌生物學特性11
• 1.3 結核疫苗現(xiàn)狀11-12
• 1.4 結核分枝桿菌免疫逃逸機制12-13
• 1.5 雙組份調控系統(tǒng)13-14
• 1.6 孤兒反應調節(jié)因子Rv081814-17
• 2 研究目的與意義17-18
• 3 材料與方法18-36
• 3.1 材料18-22
• 3.1.1 菌株、細胞及載體18
• 3.1.2 工具酶及主要試劑18-19
• 3.1.3 培養(yǎng)基及抗生素19
• 3.1.4 溶液及緩沖液19-21
• 3.1.5 引物21-22
• 3.1.6 主要儀器22
• 3.2 方法22-36
• 3.2.1 結核分枝桿菌的培養(yǎng)與傳代22-23
• 3.2.2 結核分枝桿菌全基因組的提取23
• 3.2.3 重組p0004s的構建23-27
• 3.2.4 重組ph AE159的構建27-28
• 3.2.5 重組分枝桿菌噬菌體的誘導28-29
• 3.2.6 基因缺失株的構建與鑒定29-30
• 3.2.7 結核分枝桿菌Rv0818多克隆抗體的制備30-32
• 3.2.8 Rv0818缺失株表型實驗32-36
• 4 結果與分析36-46
• 4.1 結核分枝桿菌缺失株的構建36-40
• 4.1.1 重組p0004s的構建36-37
• 4.1.2 重組ph AE159的構建37-38
• 4.1.3 重組噬菌體PCR鑒定38-39
• 4.1.4 基因缺失株PCR鑒定39-40
• 4.2 兔抗Rv0818多克隆抗體的制備40-42
• 4.2.1 Rv0818原核表達菌株的鑒定40
• 4.2.2 Rv0818-his蛋白的純化40-41
• 4.2.3 兔抗Rv0818多克隆抗體檢測41-42
• 4.3 Rv0818缺失株表型實驗42-46
• 4.3.1 菌落形態(tài)學觀察42
• 4.3.2 NO殺傷實驗42-44
• 4.3.3 胞內存活實驗44-45
• 4.3.4 熒光定量PCR45-46
• 5 討論46-49
• 5.1 結核分枝桿菌基因缺失平臺的構建46
• 5.2 Rv0818多克隆抗體的制備46-47
• 5.3 缺失株表型實驗47-49
• 6 結論49-50
• 參考文獻50-58
• 致謝58

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉二勇;周林;成詩明;;結核分枝桿菌潛伏性感染及預防性治療研究進展的系統(tǒng)評價[J];中國防癆雜志;2013年04期

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本文編號：956089