本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌孤兒反應(yīng)調(diào)節(jié)因子Rv0818基因缺失株的構(gòu)建及功能的初步研究

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【摘要】：結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中生存需要面對多種極端的環(huán)境,如缺氧、一氧化氮?dú)�、營養(yǎng)缺乏等等。雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)對于結(jié)核分桿菌在這些極端環(huán)境中存活至關(guān)重要。目前對于雙組份調(diào)控系統(tǒng)孤兒反應(yīng)調(diào)節(jié)因子Rv0818的功能及上游信號(hào)研究較少。本實(shí)驗(yàn)利用溫敏性噬菌體介導(dǎo)的結(jié)核分枝桿菌敲除方法構(gòu)建了Rv0818單基因缺失株。通過比較缺失株與野生株在固體平板上形態(tài)學(xué)特征、對于一氧化氮的耐受以及在巨噬細(xì)胞中的存活情況,觀察Rv0818缺失對結(jié)核分枝桿菌的影響。并通過檢測Rv0818下游基因表達(dá)量變化,驗(yàn)證了Rv0818作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用。本實(shí)驗(yàn)為結(jié)核病致病機(jī)理的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),同時(shí)給結(jié)核疫苗的研制提供了備選的基因缺失菌株。1結(jié)核分枝桿菌基因缺失株的構(gòu)建與鑒定實(shí)驗(yàn)成功將Rv0818同源重組區(qū)域插入到分枝桿菌噬菌體中,并利用噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌得到了能在Hyg抗性平板上生長的陽性克隆子。通過PCR鑒定和測序鑒定確定了目的基因被抗性區(qū)域替換,成功構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌基因缺失株。2形態(tài)學(xué)特性比較實(shí)驗(yàn)比較了野生株與突變株在固體平板上的形態(tài)學(xué)特征。結(jié)果顯示缺失株在固體平板上生長形成更少的索狀結(jié)構(gòu),而索狀結(jié)構(gòu)的形成與菌株的個(gè)體大小、生長速率以及細(xì)胞壁外層結(jié)構(gòu)密切相關(guān),預(yù)示著Rv0818缺失株毒力的減弱。3 NO耐受能力的比較實(shí)驗(yàn)比較了野生株和缺失株在NO刺激條件下的生長情況。結(jié)果顯示野生株與缺失株的生長會(huì)受到高濃度NO的抑制。而野生株能夠更快從NO抑制作用中恢復(fù),說明Rv0818的缺失影響了菌株對環(huán)境的適應(yīng)能力。4胞內(nèi)存活能力的比較實(shí)驗(yàn)比較了巨噬細(xì)胞對野生株與突變株的吞噬率,結(jié)果顯示缺失株更容易被巨噬細(xì)胞吞噬。實(shí)驗(yàn)還比較了菌株在感染細(xì)胞后24h、48h、72h的存活情況。結(jié)果顯示缺失株在胞內(nèi)活菌數(shù)基本不變,而野生株活菌數(shù)在感染72h時(shí)增加了3倍,說明Rv0818的缺失使菌株在胞內(nèi)的存活能力下降。5 Rv0818下游基因表達(dá)量變化實(shí)驗(yàn)比較了Rv0818缺失時(shí)部分基因表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示Rv0818缺失后,NO耐受相關(guān)基因的表達(dá)量顯著上升,同時(shí)代謝相關(guān)基因表達(dá)量顯著下調(diào),驗(yàn)證了Rv0818對這些基因的調(diào)節(jié)作用。6兔抗Rv0818多克隆抗體的制備實(shí)驗(yàn)制備了兔抗Rv0818多克隆抗體,并通過Western Blot驗(yàn)證了其使用效果,結(jié)果顯示該抗體可以用于Rv0818后續(xù)功能的研究。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 孤兒反應(yīng)調(diào)節(jié)因子 Rv0818 GlnR 基因缺失 NO耐受
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.618
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 縮略表9-10
• 1 前言10-17
• 1.1 結(jié)核病現(xiàn)狀10-11
• 1.2 結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)特性11
• 1.3 結(jié)核疫苗現(xiàn)狀11-12
• 1.4 結(jié)核分枝桿菌免疫逃逸機(jī)制12-13
• 1.5 雙組份調(diào)控系統(tǒng)13-14
• 1.6 孤兒反應(yīng)調(diào)節(jié)因子Rv081814-17
• 2 研究目的與意義17-18
• 3 材料與方法18-36
• 3.1 材料18-22
• 3.1.1 菌株、細(xì)胞及載體18
• 3.1.2 工具酶及主要試劑18-19
• 3.1.3 培養(yǎng)基及抗生素19
• 3.1.4 溶液及緩沖液19-21
• 3.1.5 引物21-22
• 3.1.6 主要儀器22
• 3.2 方法22-36
• 3.2.1 結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)與傳代22-23
• 3.2.2 結(jié)核分枝桿菌全基因組的提取23
• 3.2.3 重組p0004s的構(gòu)建23-27
• 3.2.4 重組ph AE159的構(gòu)建27-28
• 3.2.5 重組分枝桿菌噬菌體的誘導(dǎo)28-29
• 3.2.6 基因缺失株的構(gòu)建與鑒定29-30
• 3.2.7 結(jié)核分枝桿菌Rv0818多克隆抗體的制備30-32
• 3.2.8 Rv0818缺失株表型實(shí)驗(yàn)32-36
• 4 結(jié)果與分析36-46
• 4.1 結(jié)核分枝桿菌缺失株的構(gòu)建36-40
• 4.1.1 重組p0004s的構(gòu)建36-37
• 4.1.2 重組ph AE159的構(gòu)建37-38
• 4.1.3 重組噬菌體PCR鑒定38-39
• 4.1.4 基因缺失株P(guān)CR鑒定39-40
• 4.2 兔抗Rv0818多克隆抗體的制備40-42
• 4.2.1 Rv0818原核表達(dá)菌株的鑒定40
• 4.2.2 Rv0818-his蛋白的純化40-41
• 4.2.3 兔抗Rv0818多克隆抗體檢測41-42
• 4.3 Rv0818缺失株表型實(shí)驗(yàn)42-46
• 4.3.1 菌落形態(tài)學(xué)觀察42
• 4.3.2 NO殺傷實(shí)驗(yàn)42-44
• 4.3.3 胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)44-45
• 4.3.4 熒光定量PCR45-46
• 5 討論46-49
• 5.1 結(jié)核分枝桿菌基因缺失平臺(tái)的構(gòu)建46
• 5.2 Rv0818多克隆抗體的制備46-47
• 5.3 缺失株表型實(shí)驗(yàn)47-49
• 6 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-58
• 致謝58

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉二勇;周林;成詩明;;結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染及預(yù)防性治療研究進(jìn)展的系統(tǒng)評價(jià)[J];中國防癆雜志;2013年04期

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本文編號(hào)：956089