本文關鍵詞：新城疫病毒HN蛋白的可溶性超表達與免疫活性檢測

  更多相關文章： 新城疫 血凝素-神經(jīng)氨酸酶 柔性接頭 可溶性超表達 融合標簽 疫苗 診斷試劑

【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)被稱為亞洲雞瘟或者偽雞瘟。是由新城疫病毒(NDV)引起的急性高度接觸性傳染病。目前,新城疫在我國仍然十分流行,給我國的養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失,嚴重威脅我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展,故新城疫的防治十分重要。在我國主要以疫苗接種來防控該病的蔓延,使用傳統(tǒng)疫苗可以預防新城疫,但與傳統(tǒng)疫苗相比,將NDV基因組中一個或多個保護性抗原在原核或真核細胞中表達從而制備成亞單位疫苗更具有安全性能高、穩(wěn)定性好、易于批量生產(chǎn)及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。ND亞單位疫苗的制備主要以病毒囊膜表面的致病性糖蛋白為主。近年來新城疫亞單位疫苗的研究熱點仍以HN蛋白為主,它與病毒的致病性和免疫原性密切相關,是決定病毒毒力的重要因素。而大量制備HN蛋白主要以大腸桿菌表達系統(tǒng)為主,大腸桿菌作為外源蛋白表達系統(tǒng)具有培養(yǎng)所需碳源價格便宜、細胞生長迅速和易于規(guī)�；囵B(yǎng)等優(yōu)點。然而,目前在大腸桿菌中高效表達可溶性外源蛋白還比較困難。有研究表明,在大腸桿菌表達系統(tǒng)中,采用融合標簽與目的基因一起進行融合表達可以提高目的蛋白的可溶性表達量,然而,目前沒有一個標簽可以促進所有目的蛋白的可溶性表達。本試驗采用融合表達的方法將人工合成的HN-SF基因分別與Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB這10種融合標簽基因采用柔性接頭進行連接,構建10個重組表達載體,經(jīng)菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定及測序正確后,將這10個重組表達載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中,用不同條件進行誘導表達,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,并用生物軟件ImageJ分析并選出最佳誘導蛋白表達的條件,篩選出能夠顯著促進重組HN蛋白可溶性表達的標簽。為了消除標簽自身大小對表達量的影響,采用Western blot對所表達蛋白的含量進行定量分析。同時檢測純化的重組HN蛋白能否形成衣殼樣納米顆粒,用透射式電子顯微鏡觀察其形態(tài)結構,純化的重組HN蛋白用免疫印跡和間接ELISA檢測其免疫活性。結果表明,成功將合成的HN-SF基因連接到帶有標簽的10個表達載體上,經(jīng)菌液PCR、雙酶切和測序鑒定正確,表明成功構建含有6×His-Grifin-TEV-HN-SF、6×His-GST-TEV-HN-SF、6×His-MBP-TEV-HN-SF、6×His-Nus A-TEV-HN-SF、6×His-SUMO-TEV-HN-SF、6×His-Thioredoxin-TEV-HN-SF、6×His-Protein G-TEV-HN-SF、6×His-γ-crystallin-TEV-HN-SF、6×His-Ars C-TEV-HN-SF、6×His-Ppi B-TEV-HN-SF的10個表達載體。用不同的條件進行誘導表達,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測并用生物軟件選出最佳誘導重組HN蛋白表達的條件為:誘導溫度為16℃、IPTG的濃度為0.4 mmol/L、Amp的濃度為200μg/mL和LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。在最佳誘導條件下顯示:10個重組表達載體中只有N-端連接ProteinG標簽沒有檢測到目的蛋白的表達,其余9個重組載體都有目的蛋白的表達。用Image J軟件對可溶性表達量進行定量分析表明,pET3-HN可溶性表達量最高(62.7%),其次分別為p ET 2-HN(42.2%)、pET 5-HN(40.8%)、pET 6-HN(40.4%)、pET1-HN(39.5%)、pET7-HN(36.0%)、pET10-HN(27.3%)、pET 9-HN(26.8%)、pET 4-HN(5.2%)。篩選出融合標簽MBP能夠有效促進HN蛋白可溶性表達。為了消除標簽自身大小對表達量的影響,選出可溶性表達量最高的兩組(GST組和MBP組),用抗His標簽的抗體對其可溶性表達量進行定量分析,Western blot結果表明最佳融合標簽是MBP標簽。隨后對重組HN蛋白進行純化,SDS-PAGE分析無其它雜帶,表明純化的蛋白純度高,用超濾管濃縮純化產(chǎn)物,其濃度達到1.6 mg/m L;在透射電子顯微鏡下觀察重組HN蛋白能組裝成衣殼樣納米顆粒的結構,經(jīng)Western blot和間接ELISA檢測分析表明截短表達的重組HN蛋白主要抗原區(qū)域具有良好的反應性與特異性,顯示出良好的應用前景。融合標簽MBP能顯著提高HN蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達量,為解決HN蛋白不可溶性表達和可溶性表達量低這一難題提供了新的方法和思路,同時為研究NDV的作用機制、有效疫苗的研制及診斷試劑的研制和開發(fā)奠定了基礎,且對病毒性疾病的防治提供了參考依據(jù)。
【關鍵詞】：新城疫 血凝素-神經(jīng)氨酸酶 柔性接頭 可溶性超表達 融合標簽 疫苗 診斷試劑
【學位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 致謝4-8
• 摘要8-10
• 常用縮略詞10-11
• 1 文獻綜述11-24
• 1.1 新城疫病毒的概述11-14
• 1.1.1 NDV形態(tài)特征與理化特性11
• 1.1.2 基因組特性11-12
• 1.1.3 NDV的致病性12-13
• 1.1.4 ND的流行病學13-14
• 1.2 新城疫檢測方法的研究14-16
• 1.2.1 臨床癥狀和病理變化檢測14
• 1.2.2 血清學診斷14-15
• 1.2.3 分子生物學診斷15-16
• 1.3 HN蛋白的研究進展16-19
• 1.3.1 HN蛋白的結構16-17
• 1.3.2 HN蛋白的功能17-18
• 1.3.3 HN蛋白的應用18-19
• 1.4 融合標簽19-24
• 1.4.1 融合標簽技術19-20
• 1.4.2 融合標簽的特點20-21
• 1.4.3 載體上的標簽21-24
• 1.4.3.1 His標簽21
• 1.4.3.2 Grifin標簽21
• 1.4.3.3 GST標簽21
• 1.4.3.4 MBP標簽21-22
• 1.4.3.5 NusA標簽22
• 1.4.3.6 SUMO標簽22-23
• 1.4.3.7 Thioredoxin標簽23
• 1.4.3.8 proteinG標簽23
• 1.4.3.9 γ-crystallin標簽23
• 1.4.3.10 ArsC標簽23
• 1.4.3.11 PpiB標簽23-24
• 2 材料24-28
• 2.1 質(zhì)粒和菌株24
• 2.2 實驗動物24
• 2.3 主要儀器24
• 2.4 主要試劑24
• 2.5 常規(guī)溶液的配制24-28
• 3 方法28-35
• 3.1 目的基因和引物的合成28
• 3.2 重組表達載體的構建28-31
• 3.2.1 標簽載體的構建28-29
• 3.2.2 大腸桿菌DH5α和BL21感受態(tài)細胞的制備（CaCl_2法）29-30
• 3.2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化30
• 3.2.4 重組表達載體的構建30-31
• 3.3 重組質(zhì)粒的鑒定31-32
• 3.3.1 菌液PCR鑒定31
• 3.3.2 雙酶切鑒定31-32
• 3.4 序列測定32
• 3.5 重組HN蛋白誘導條件的優(yōu)化32-33
• 3.5.1 最佳IPTG誘導濃度的確定32
• 3.5.2 最佳誘導溫度的確定32
• 3.5.3 最佳Amp濃度的確定32
• 3.5.4 最佳誘導時間的確定32-33
• 3.5.5 最佳培養(yǎng)基的確定33
• 3.6 重組HN蛋白表達量的鑒定33-34
• 3.7 重組HN蛋白的純化34
• 3.8 重組HN蛋白形態(tài)學分析34
• 3.9 重組HN蛋白的免疫活性檢測34-35
• 3.9.1 Western blot檢測34-35
• 3.9.2 間接ELISA檢測35
• 4 結果與分析35-41
• 4.1 重組表達載體的構建35-36
• 4.1.1 標簽質(zhì)粒和pET 21b的雙酶35-36
• 4.1.2 目的基因與pET的雙酶切36
• 4.2 重組質(zhì)粒的鑒定36-37
• 4.2.1 菌液PCR鑒定36
• 4.2.2 雙酶切鑒定36-37
• 4.3 重組HN蛋白誘導條件的優(yōu)化37-38
• 4.4 重組HN蛋白表達量的鑒定38-39
• 4.5 重組HN蛋白的純化39
• 4.6 重組HN蛋白形態(tài)學分析39-40
• 4.7 重組HN蛋白免疫活性檢測40-41
• 4.7.1 Western blot檢測40
• 4.7.2 間接ELISA檢測40-41
• 5 討論41-42
• 全文總結42-43
• 參考文獻43-52
• Abstract52-54

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