本文關(guān)鍵詞：新城疫病毒HN蛋白的可溶性超表達(dá)與免疫活性檢測(cè)

  更多相關(guān)文章： 新城疫 血凝素-神經(jīng)氨酸酶 柔性接頭 可溶性超表達(dá) 融合標(biāo)簽 疫苗 診斷試劑

【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)被稱為亞洲雞瘟或者偽雞瘟。是由新城疫病毒(NDV)引起的急性高度接觸性傳染病。目前,新城疫在我國(guó)仍然十分流行,給我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重威脅我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展,故新城疫的防治十分重要。在我國(guó)主要以疫苗接種來防控該病的蔓延,使用傳統(tǒng)疫苗可以預(yù)防新城疫,但與傳統(tǒng)疫苗相比,將NDV基因組中一個(gè)或多個(gè)保護(hù)性抗原在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)從而制備成亞單位疫苗更具有安全性能高、穩(wěn)定性好、易于批量生產(chǎn)及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。ND亞單位疫苗的制備主要以病毒囊膜表面的致病性糖蛋白為主。近年來新城疫亞單位疫苗的研究熱點(diǎn)仍以HN蛋白為主,它與病毒的致病性和免疫原性密切相關(guān),是決定病毒毒力的重要因素。而大量制備HN蛋白主要以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為主,大腸桿菌作為外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)所需碳源價(jià)格便宜、細(xì)胞生長(zhǎng)迅速和易于規(guī)模化培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。然而,目前在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性外源蛋白還比較困難。有研究表明,在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中,采用融合標(biāo)簽與目的基因一起進(jìn)行融合表達(dá)可以提高目的蛋白的可溶性表達(dá)量,然而,目前沒有一個(gè)標(biāo)簽可以促進(jìn)所有目的蛋白的可溶性表達(dá)。本試驗(yàn)采用融合表達(dá)的方法將人工合成的HN-SF基因分別與Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB這10種融合標(biāo)簽基因采用柔性接頭進(jìn)行連接,構(gòu)建10個(gè)重組表達(dá)載體,經(jīng)菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定及測(cè)序正確后,將這10個(gè)重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中,用不同條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),并用生物軟件ImageJ分析并選出最佳誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的條件,篩選出能夠顯著促進(jìn)重組HN蛋白可溶性表達(dá)的標(biāo)簽。為了消除標(biāo)簽自身大小對(duì)表達(dá)量的影響,采用Western blot對(duì)所表達(dá)蛋白的含量進(jìn)行定量分析。同時(shí)檢測(cè)純化的重組HN蛋白能否形成衣殼樣納米顆粒,用透射式電子顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu),純化的重組HN蛋白用免疫印跡和間接ELISA檢測(cè)其免疫活性。結(jié)果表明,成功將合成的HN-SF基因連接到帶有標(biāo)簽的10個(gè)表達(dá)載體上,經(jīng)菌液PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定正確,表明成功構(gòu)建含有6×His-Grifin-TEV-HN-SF、6×His-GST-TEV-HN-SF、6×His-MBP-TEV-HN-SF、6×His-Nus A-TEV-HN-SF、6×His-SUMO-TEV-HN-SF、6×His-Thioredoxin-TEV-HN-SF、6×His-Protein G-TEV-HN-SF、6×His-γ-crystallin-TEV-HN-SF、6×His-Ars C-TEV-HN-SF、6×His-Ppi B-TEV-HN-SF的10個(gè)表達(dá)載體。用不同的條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)并用生物軟件選出最佳誘導(dǎo)重組HN蛋白表達(dá)的條件為:誘導(dǎo)溫度為16℃、IPTG的濃度為0.4 mmol/L、Amp的濃度為200μg/mL和LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。在最佳誘導(dǎo)條件下顯示:10個(gè)重組表達(dá)載體中只有N-端連接ProteinG標(biāo)簽沒有檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá),其余9個(gè)重組載體都有目的蛋白的表達(dá)。用Image J軟件對(duì)可溶性表達(dá)量進(jìn)行定量分析表明,pET3-HN可溶性表達(dá)量最高(62.7%),其次分別為p ET 2-HN(42.2%)、pET 5-HN(40.8%)、pET 6-HN(40.4%)、pET1-HN(39.5%)、pET7-HN(36.0%)、pET10-HN(27.3%)、pET 9-HN(26.8%)、pET 4-HN(5.2%)。篩選出融合標(biāo)簽MBP能夠有效促進(jìn)HN蛋白可溶性表達(dá)。為了消除標(biāo)簽自身大小對(duì)表達(dá)量的影響,選出可溶性表達(dá)量最高的兩組(GST組和MBP組),用抗His標(biāo)簽的抗體對(duì)其可溶性表達(dá)量進(jìn)行定量分析,Western blot結(jié)果表明最佳融合標(biāo)簽是MBP標(biāo)簽。隨后對(duì)重組HN蛋白進(jìn)行純化,SDS-PAGE分析無其它雜帶,表明純化的蛋白純度高,用超濾管濃縮純化產(chǎn)物,其濃度達(dá)到1.6 mg/m L;在透射電子顯微鏡下觀察重組HN蛋白能組裝成衣殼樣納米顆粒的結(jié)構(gòu),經(jīng)Western blot和間接ELISA檢測(cè)分析表明截短表達(dá)的重組HN蛋白主要抗原區(qū)域具有良好的反應(yīng)性與特異性,顯示出良好的應(yīng)用前景。融合標(biāo)簽MBP能顯著提高HN蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)量,為解決HN蛋白不可溶性表達(dá)和可溶性表達(dá)量低這一難題提供了新的方法和思路,同時(shí)為研究NDV的作用機(jī)制、有效疫苗的研制及診斷試劑的研制和開發(fā)奠定了基礎(chǔ),且對(duì)病毒性疾病的防治提供了參考依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：新城疫 血凝素-神經(jīng)氨酸酶 柔性接頭 可溶性超表達(dá) 融合標(biāo)簽 疫苗 診斷試劑
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 致謝4-8
• 摘要8-10
• 常用縮略詞10-11
• 1 文獻(xiàn)綜述11-24
• 1.1 新城疫病毒的概述11-14
• 1.1.1 NDV形態(tài)特征與理化特性11
• 1.1.2 基因組特性11-12
• 1.1.3 NDV的致病性12-13
• 1.1.4 ND的流行病學(xué)13-14
• 1.2 新城疫檢測(cè)方法的研究14-16
• 1.2.1 臨床癥狀和病理變化檢測(cè)14
• 1.2.2 血清學(xué)診斷14-15
• 1.2.3 分子生物學(xué)診斷15-16
• 1.3 HN蛋白的研究進(jìn)展16-19
• 1.3.1 HN蛋白的結(jié)構(gòu)16-17
• 1.3.2 HN蛋白的功能17-18
• 1.3.3 HN蛋白的應(yīng)用18-19
• 1.4 融合標(biāo)簽19-24
• 1.4.1 融合標(biāo)簽技術(shù)19-20
• 1.4.2 融合標(biāo)簽的特點(diǎn)20-21
• 1.4.3 載體上的標(biāo)簽21-24
• 1.4.3.1 His標(biāo)簽21
• 1.4.3.2 Grifin標(biāo)簽21
• 1.4.3.3 GST標(biāo)簽21
• 1.4.3.4 MBP標(biāo)簽21-22
• 1.4.3.5 NusA標(biāo)簽22
• 1.4.3.6 SUMO標(biāo)簽22-23
• 1.4.3.7 Thioredoxin標(biāo)簽23
• 1.4.3.8 proteinG標(biāo)簽23
• 1.4.3.9 γ-crystallin標(biāo)簽23
• 1.4.3.10 ArsC標(biāo)簽23
• 1.4.3.11 PpiB標(biāo)簽23-24
• 2 材料24-28
• 2.1 質(zhì)粒和菌株24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24
• 2.3 主要儀器24
• 2.4 主要試劑24
• 2.5 常規(guī)溶液的配制24-28
• 3 方法28-35
• 3.1 目的基因和引物的合成28
• 3.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建28-31
• 3.2.1 標(biāo)簽載體的構(gòu)建28-29
• 3.2.2 大腸桿菌DH5α和BL21感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaCl_2法）29-30
• 3.2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化30
• 3.2.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建30-31
• 3.3 重組質(zhì)粒的鑒定31-32
• 3.3.1 菌液PCR鑒定31
• 3.3.2 雙酶切鑒定31-32
• 3.4 序列測(cè)定32
• 3.5 重組HN蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化32-33
• 3.5.1 最佳IPTG誘導(dǎo)濃度的確定32
• 3.5.2 最佳誘導(dǎo)溫度的確定32
• 3.5.3 最佳Amp濃度的確定32
• 3.5.4 最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定32-33
• 3.5.5 最佳培養(yǎng)基的確定33
• 3.6 重組HN蛋白表達(dá)量的鑒定33-34
• 3.7 重組HN蛋白的純化34
• 3.8 重組HN蛋白形態(tài)學(xué)分析34
• 3.9 重組HN蛋白的免疫活性檢測(cè)34-35
• 3.9.1 Western blot檢測(cè)34-35
• 3.9.2 間接ELISA檢測(cè)35
• 4 結(jié)果與分析35-41
• 4.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建35-36
• 4.1.1 標(biāo)簽質(zhì)粒和pET 21b的雙酶35-36
• 4.1.2 目的基因與pET的雙酶切36
• 4.2 重組質(zhì)粒的鑒定36-37
• 4.2.1 菌液PCR鑒定36
• 4.2.2 雙酶切鑒定36-37
• 4.3 重組HN蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化37-38
• 4.4 重組HN蛋白表達(dá)量的鑒定38-39
• 4.5 重組HN蛋白的純化39
• 4.6 重組HN蛋白形態(tài)學(xué)分析39-40
• 4.7 重組HN蛋白免疫活性檢測(cè)40-41
• 4.7.1 Western blot檢測(cè)40
• 4.7.2 間接ELISA檢測(cè)40-41
• 5 討論41-42
• 全文總結(jié)42-43
• 參考文獻(xiàn)43-52
• Abstract52-54

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 吳珊珊;朱蕓;陳珊珊;何冰芳;;融合標(biāo)簽在蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)中的應(yīng)用進(jìn)展[J];化工進(jìn)展;2014年04期

2 劉爽,胡寶成;原核系統(tǒng)可溶性表達(dá)策略[J];生物技術(shù)通訊;2005年02期

3 陳丹;胡又佳;朱春寶;朱寶泉;;頂頭孢霉乙酰轉(zhuǎn)移酶的可溶性表達(dá)優(yōu)化和酶動(dòng)力學(xué)[J];中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志;2007年09期

4 范開;譚克海;張淳;張益;;大腸桿菌中可溶性表達(dá)重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21及制備[J];重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué));2011年05期

5 孫永紅;高紅亮;詹曉瑩;李文娟;李雪嬌;;Aβ_(1-42)淀粉樣蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2009年02期

6 孫晉華,洪岸,張玲,孫奮勇,宋照雷;大腸桿菌可溶性表達(dá)人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的研究[J];微生物學(xué)報(bào);2003年04期

7 郭凱;趙曉燕;周紅姿;陳凱;李紀(jì)順;陳泉;楊合同;;重組人促性腺激素-銅綠假單胞菌外毒素A蛋白的可溶性表達(dá)、純化和對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性[J];山東科學(xué);2013年02期

8 范敏;徐暢;李彥;孫文敬;溫娜;;重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子1的原核可溶性表達(dá)及活性鑒定[J];生物技術(shù)通訊;2011年06期

9 孫傳秀;趙文志;何盛為;方旭;米立東;杜廣宇;張路;;重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)和純化[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2009年07期

10 崔立斌,馬清鈞;新生肽鏈的折疊與重組蛋白可溶性表達(dá)[J];生物工程進(jìn)展;1998年01期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 余波;程安春;汪銘書;;提高大腸桿菌可溶性表達(dá)重組蛋白的研究進(jìn)展[A];第四屆第九次全國(guó)學(xué)術(shù)研討會(huì)暨飼料和動(dòng)物源食品安全戰(zhàn)略論壇論文集（下冊(cè)）[C];2008年

2 徐曉健;宋長(zhǎng)征;呂麗燕;;化學(xué)分子伴侶對(duì)重組oIFN-tau在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的影響[A];山東生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2009年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

3 劉明軍;錢冬萌;王斌;;重組人白細(xì)胞介素21在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)與純化[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

4 言慧;陳曉光;李華;周曉紅;吳昆;;弓形蟲SAG1基因截短片段的克隆、可溶性表達(dá)及活性鑒定[A];中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)原生動(dòng)物學(xué)分會(huì)第十二次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編[C];2003年

5 吳行偉;劉澤源;張琴;曲恒燕;;重組蛋白TAT-tCNTF的可溶性表達(dá)[A];第十三次全國(guó)臨床藥理學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2012年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 記者 白毅;FGF關(guān)鍵工程技術(shù)及應(yīng)用研究獲國(guó)家技術(shù)發(fā)明獎(jiǎng)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2010年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 潘東;人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的提升研究[D];吉林大學(xué);2016年

2 姜世民;D-氨甲酰水解酶可溶性表達(dá)的遺傳改造和結(jié)構(gòu)與功能研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2007年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王貞貞;UMT作為紅色熒光報(bào)告蛋白在大腸桿菌的功能和可溶性表達(dá)[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 郝旭;富含精氨酸短肽融合蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)[D];吉林大學(xué);2016年

3 郭永華;嗜熱環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的分子改造[D];福建農(nóng)林大學(xué);2016年

4 劉佳林;重組融合蛋白在E.coli中可溶性表達(dá)及抗原活性研究[D];吉林大學(xué);2016年

5 張偉強(qiáng);新城疫病毒HN蛋白的可溶性超表達(dá)與免疫活性檢測(cè)[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

6 郭雯雯;人源化單域抗體在大腸桿菌表達(dá)體系內(nèi)的可溶性表達(dá)水平與其氨基酸組成的關(guān)聯(lián)研究[D];江南大學(xué);2015年

7 張崇旭;金黃色葡萄球菌腸毒素B的可溶性表達(dá)及單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建[D];陜西師范大學(xué);2004年

8 曹麗娟;超酸性蛋白融合標(biāo)簽對(duì)大腸桿菌中重組蛋白可溶性表達(dá)的作用研究[D];華東師范大學(xué);2008年

9 付紅梅;大腸桿菌非融合可溶性表達(dá)載體的構(gòu)建[D];吉林大學(xué);2008年

10 魏笑蓮;海洋新型酯酶的克隆、表達(dá)及應(yīng)用[D];浙江大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：948369