本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲SjC1qBP基因的克隆表達及生物學(xué)功能研究

  更多相關(guān)文章： 日本血吸蟲 SjC1qBP基因 免疫保護效果 補體 免疫逃避

【摘要】：血吸蟲病是一種分布廣泛、危害嚴重的人畜共患寄生蟲病;目前,全球約有兩億人受到感染,八億人面臨著被感染的威脅。吡喹酮是血吸蟲病治療的首選藥物,但其30多年的使用歷史可能導(dǎo)致宿主產(chǎn)生耐藥性,并且該藥不能解決重復(fù)感染的問題。一直以來,研發(fā)血吸蟲免疫預(yù)防疫苗是研究的熱點方向之一,但研究進展相當(dāng)緩慢,目前仍然缺乏有效的抗血吸蟲病疫苗。處于機體防御第一線的補體系統(tǒng)是宿主殺傷血液內(nèi)寄生蟲的重要途徑,可以迅速標記并清除入侵的病原微生物,介導(dǎo)體液免疫和細胞免疫,是機體中重要的免疫調(diào)控和效應(yīng)級聯(lián)放大系統(tǒng);血吸蟲在長期的進化過程中形成了非常成功的免疫逃避策略,一些血吸蟲分子能夠調(diào)節(jié)宿主的補體系統(tǒng),這些分子對血吸蟲在終末宿主體內(nèi)的生存和發(fā)育起著極其重要的作用,是潛在的疫苗候選分子和理想的藥物靶標。在日本血吸蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究中曾鑒定到C1q結(jié)合蛋白(C1qBP),推測其可能和日本血吸蟲的補體抑制相關(guān)。本研究通過PCR擴增了日本血吸蟲C1q結(jié)合蛋白(SjC1qBP)基因的開放閱讀框,經(jīng)生物信息學(xué)分析表明該基因ORF含729個核苷酸,編碼242個氨基酸殘基,既不存在跨膜區(qū),也不存在信號肽,二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示該基因編碼的多肽以無規(guī)則卷曲為主,SMART軟件分析該蛋白氨基酸序列結(jié)果顯示其屬于Pfam家族蛋白含有MAM33結(jié)構(gòu)域,推測其具有補體C1q結(jié)合位點;RT-PCR分析表明SjC1qBP基因在日本血吸蟲的各個發(fā)育階段均可轉(zhuǎn)錄,其中在尾蚴中的轉(zhuǎn)錄水平相對較高,而在蟲卵等其他階段其轉(zhuǎn)錄水平大致相當(dāng);免疫組化實驗結(jié)果顯示SjC1qBP蛋白在蟲卵中有分布、在日本血吸蟲成蟲中主要分布于體被。本研究構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET-32a(+)-SjC1qBP,并在大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中成功表達,并應(yīng)用親和層析方法純化獲得了包涵體重組蛋白,利用尿素濃度梯度透析得到了復(fù)性的重組蛋白分子rSjC1qBP;Western-blot檢測結(jié)果表明rSjC1qBP具有良好的反應(yīng)原性和免疫原性;動物免疫保護實驗中,該重組蛋白誘導(dǎo)了有31.48%的減蟲率以及45.12%的肝臟減卵率,同時重組蛋白rSjC1qBP分子經(jīng)凝血酶酶切后獲得的蛋白亞單位也誘導(dǎo)產(chǎn)生了顯著的免疫保護效果;對該重組蛋白分子誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答分析表明,重組蛋白分子rSjC1qBP在首次免疫后就產(chǎn)生了較高水平的特異性抗體IgG,且抗體水平隨免疫次數(shù)的增加而不斷升高,到小鼠感染42d剖殺前抗體水平仍維持高水平。綿羊紅細胞溶血抑制實驗的檢測結(jié)果表明,重組蛋白分子rSjC1qBP抑制補體溶血的現(xiàn)象非常明顯,并且隨著重組蛋白rSjC1qBP分子濃度的增加抑制作用越明顯,在濃度達到1.5mg/mL時,溶血反應(yīng)抑制率大于80%。在補體分子結(jié)合實驗中,重組蛋白分子rSjC1qBP能特異地與C1q蛋白結(jié)合,表明日本血吸蟲重組蛋白分子rSjC1qBP能夠競爭性結(jié)合C1q,從而抑制補體經(jīng)典途徑。本研究結(jié)果表明,日本血吸蟲SjC1qBP能通過結(jié)合補體C1q而抑制宿主補體溶血,該分子還具有血吸蟲疫苗候選抗原分子的潛力,結(jié)果不僅拓展了對SjC1qBP基因功能的認識,為深入探究C1qBP的生物學(xué)功能奠定了堅實的基礎(chǔ),還為闡述日本血吸蟲的免疫逃避機制提供了有價值的信息。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲 SjC1qBP基因 免疫保護效果 補體 免疫逃避
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.735
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 文獻綜述13-23
• 1.1 引言13-16
• 1.2 血吸蟲的免疫逃避16-19
• 1.2.1 體被的隔離16-17
• 1.2.2 抗原變異17-18
• 1.2.3 分子模擬或偽裝18
• 1.2.4 調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答18
• 1.2.5 小結(jié)18-19
• 1.3 血吸蟲與補體系統(tǒng)19-23
• 1.3.1 經(jīng)典途徑（classical pathway）19-20
• 1.3.2 替代途徑（alternative pathway）和MBL途徑20-21
• 1.3.3 小結(jié)21-23
• 第二章 日本血吸蟲SjC1qBP基因的克隆及其表達特性分析23-40
• 2.1 引言23-24
• 2.2 實驗材料24-25
• 2.2.1 生物材料24
• 2.2.2 主要儀器24
• 2.2.3 酶和試劑24
• 2.2.4 試劑配制24-25
• 2.3 實驗方法25-30
• 2.3.1 日本血吸蟲SjC1qBP基因的克隆25-28
• 2.3.2 日本血吸蟲SjC1qBP基因的生物信息學(xué)分析28
• 2.3.3 熒光RT-PCR分析C1qBP在日本血吸蟲不同時期和性別中的轉(zhuǎn)錄水平28-29
• 2.3.4 SjC1qBP在日本血吸蟲中的組織定位29-30
• 2.4 實驗結(jié)果30-38
• 2.4.1 日本血吸蟲SjC1qBP基因克隆30-32
• 2.4.2 日本血吸蟲SjC1qBP生物信息學(xué)分析32-35
• 2.4.3 RT-PCR分析日本血吸蟲SjC1qBP在不同期別蟲體中的轉(zhuǎn)錄水平差異35-37
• 2.4.4 日本血吸蟲SjC1qBP蛋白的組織定位37-38
• 2.5 討論38-40
• 第三章 日本血吸蟲SjC1qBP的表達純化及其免疫分析40-55
• 3.1 引言40
• 3.2 實驗材料40-43
• 3.2.1 生物材料40
• 3.2.2 主要儀器40-41
• 3.2.3 酶和試劑41
• 3.2.4 試劑配制41-43
• 3.3 實驗方法43-48
• 3.3.1 日本血吸蟲SjC1qBP基因的表達與純化43-47
• 3.3.2 重組蛋白rSjC1qBP的抗原性檢測47
• 3.3.3 重組蛋白rSjC1qBP的動物保護實驗47-48
• 3.3.4 特異性抗體水平的檢測48
• 3.4 實驗結(jié)果48-53
• 3.4.1 日本血吸蟲SjC1qBP基因表達與純化48-51
• 3.4.2 重組蛋白rSjC1qBP抗原性檢測51-52
• 3.4.3 重組蛋白rSjC1qBP動物保護實驗52-53
• 3.4.4 特異性抗體水平檢測53
• 3.5 討論53-55
• 第四章 日本血吸蟲SjC1qBP功能的初步探究55-61
• 4.1 引言55-56
• 4.2 實驗材料56
• 4.2.1 主要儀器56
• 4.2.2 酶和試劑56
• 4.2.3 試劑配制56
• 4.3 實驗方法56-57
• 4.3.1 重組蛋白分子rSjC1qBP的溶血實驗56-57
• 4.3.2 重組蛋白rSjC1qBP與補體C1q的結(jié)合實驗57
• 4.4 實驗結(jié)果57-59
• 4.4.1 重組蛋白分子rSjC1qBP抑制補體溶血活性57-59
• 4.4.2 重組蛋白rSjC1qBP與補體C1q結(jié)合實驗59
• 4.5 討論59-61
• 第五章 全文總結(jié)61-62
• 參考文獻62-67
• 致謝67-68
• 作者簡歷68

【參考文獻】

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本文編號：944687