本文關(guān)鍵詞：miR-126-3p調(diào)控豬卵巢顆粒細(xì)胞功能的研究

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【摘要】：卵巢是哺乳動(dòng)物重要的生殖腺,是卵泡發(fā)育和排卵的重要器官。卵泡是卵巢的結(jié)構(gòu)和功能單位,原始卵泡的正常募集、激活以及生長(zhǎng)卵泡的發(fā)育、排卵是保障母豬終身繁殖力的前提。卵泡的發(fā)育過(guò)程伴隨著顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和分化,顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡與卵泡發(fā)育卵母細(xì)胞的成長(zhǎng)發(fā)育、原始卵泡生長(zhǎng)的啟動(dòng)、生長(zhǎng)期卵泡發(fā)育的調(diào)控以及卵泡閉鎖密切相關(guān)。眾多研究表明顆粒細(xì)胞相關(guān)基因和miRNA影響著顆粒細(xì)胞功能,進(jìn)而影響卵泡生長(zhǎng)發(fā)育。本課題組前期通過(guò)對(duì)青春期前和疑似卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)后備母豬卵巢組織進(jìn)行了miRNA表達(dá)譜分析,獲得了與卵泡發(fā)育相關(guān)的miRNAs,篩選了在疑似POF后備母豬卵巢高表達(dá)的miR-126-3p為候選miRNA。本研究運(yùn)用Annexin V-FITC流式檢測(cè)、Edu熒光顯微鏡檢測(cè)、qRT-PCR和Western Blot等實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)miR-126-3p細(xì)胞生物學(xué)功能、靶基因生物學(xué)功能及其對(duì)顆粒細(xì)胞功能影響。研究結(jié)果對(duì)深入了解母豬卵巢顆粒細(xì)胞對(duì)卵泡發(fā)育分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),對(duì)進(jìn)一步了解卵巢卵泡發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制以及對(duì)畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益的提高具有重要意義。本研究結(jié)果具體如下:1.Annexin V-FITC流式檢測(cè)結(jié)果表明,miR-126-3p能夠抑制顆粒細(xì)胞凋亡。運(yùn)用Edu熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果表明,miR-126-3p能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖。2.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-126-3p靶向原始卵泡激活和休眠相關(guān)PI3K-AKT通路中的關(guān)鍵基因PIK3R2和TSC1。進(jìn)一步通過(guò)雙熒光報(bào)告基因驗(yàn)證該miRNA能夠結(jié)合PIK3R2 3’UTR和TSC1 3’UTR抑制報(bào)告基因表達(dá);qRT-PCR和Western blotting結(jié)果表明miR-126-3p能夠在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控PIK3R2,在翻譯水平負(fù)調(diào)控PIK3R2和TSC1的表達(dá)。3.Annexin V-FITC和Edu檢測(cè)表明,抑制PIK3R2和TSC1后(轉(zhuǎn)染siRNA-PIK3R2和siRNA-TSC1)能夠抑制顆粒細(xì)胞凋亡,而促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖。補(bǔ)充外源的siRNA-PIK3R2和siRNA-TSC1則能夠減弱抑制miR-126-3p引起的促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡作用和回復(fù)抑制miR-126-3p引起的抑制顆粒細(xì)胞增殖作用。4.通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA-PIK3R2和siRNA-TSC1后所在PI3K通路上下游基因的表達(dá)變化。檢測(cè)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染siRNA-PIK3R2使得IGF1R、INRS、PDK1和AKT1表達(dá)量下降,而IRS1表達(dá)量上升;PTEN表達(dá)量變化不明顯。轉(zhuǎn)染siRNA-TSC1后使得PTEN、AKT1、TSC2、rpS6和mTOR表達(dá)量上升,而PDK1表達(dá)量變化不明顯。上述結(jié)果揭示了miR-126-3p能夠通過(guò)PIK3R2和TSC1抑制豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡和促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖,為深入了解miRNA調(diào)控卵巢卵泡發(fā)育提供借鑒,同時(shí)也為后續(xù)研究PIK3-AKT通路在卵巢顆粒細(xì)胞中的研究奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬 顆粒細(xì)胞 miR-126-3p PIK3R2 TSC1
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S828
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 1 前言9-15
• 1.1 哺乳動(dòng)物卵巢結(jié)構(gòu)與功能9-10
• 1.2 顆粒細(xì)胞對(duì)卵泡發(fā)育過(guò)程的調(diào)控研究10-12
• 1.3 miRNA調(diào)控卵巢功能的研究進(jìn)展12-13
• 1.4 miR-126 調(diào)控卵巢功能的研究進(jìn)展13-14
• 1.5 研究目的與意義14
• 1.6 技術(shù)路線14-15
• 2 材料與方法15-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品15
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備15-16
• 2.1.3 主要試劑16-17
• 2.1.4 試劑配制17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-33
• 2.2.1 總RNA的提取17-18
• 2.2.2 總RNA檢測(cè)及反轉(zhuǎn)錄18-20
• 2.2.3 q RT-PCR檢測(cè)20-22
• 2.2.4 豬卵巢顆粒細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)22-23
• 2.2.5 豬卵巢顆粒細(xì)胞的接種和轉(zhuǎn)染23-24
• 2.2.6 豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡檢測(cè)24
• 2.2.7 豬卵巢顆粒細(xì)胞增殖檢測(cè)24-25
• 2.2.8 靶基因PIK3R2、TSC1的預(yù)測(cè)25
• 2.2.9 構(gòu)建靶基因雙熒光素酶報(bào)告載體25-32
• 2.2.10 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)32
• 2.2.11 Western Blot32-33
• 3 結(jié)果與分析33-50
• 3.1 miR1263p對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞功能的影響33-36
• 3.1.1 miR1263p小片段效率檢測(cè)33-34
• 3.1.2 miR1263p抑制豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡34-35
• 3.1.3 miR1263p促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞增殖35-36
• 3.2 miR1263p靶基因的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證36-43
• 3.2.1 靶基因生物信息學(xué)分析36-37
• 3.2.2 構(gòu)建靶基因雙熒光素酶報(bào)告載體、突變載體及缺失載體37-40
• 3.2.3 靶基因雙熒光活性檢測(cè)40-41
• 3.2.4 qRT-PCR檢測(cè)miR1263p對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響41-42
• 3.2.5 Western Blot檢測(cè)miR1263p對(duì)靶基因蛋白水平的影響42-43
• 3.3 靶基因TSC1、PIK3R2對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞功能的影響43-48
• 3.3.1 siPIK3R2、siTSC1干擾效率檢測(cè)43-44
• 3.3.2 干擾PIK3R2、干擾TSC1抑制豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡44-45
• 3.3.3 干擾PIK3R2、干擾TSC1促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞增殖45-46
• 3.3.4 干擾PIK3R2檢測(cè)其通路上下游基因的表達(dá)46-47
• 3.3.5 干擾TSC1檢測(cè)其通路上下游基因的表達(dá)47-48
• 3.4 miR1263p靶基因PIK3R2、TSC1功能回復(fù)驗(yàn)證48-50
• 3.4.1 靶基因PIK3R2、TSC1細(xì)胞凋亡回復(fù)驗(yàn)證48-49
• 3.4.2 靶基因PIK3R2、TSC1細(xì)胞增殖回復(fù)驗(yàn)證49-50
• 4 討論與結(jié)論50-59
• 4.1 miRNA對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞功能調(diào)控50-52
• 4.2 miRNA靶基因的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證52-54
• 4.3 PIK3R2、TSC1在豬卵巢中的研究54-57
• 4.4 miR1263p靶基因PIK3R2、TSC1功能回復(fù)驗(yàn)證57
• 4.5 結(jié)論57-59
• 致謝59-60
• 參考文獻(xiàn)60-67

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：933572