本文關(guān)鍵詞：旋毛蟲谷氨酸脫羧酶TsGAD的表達和定位及不同pH對其影響的研究

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【摘要】：旋毛蟲病是由旋毛形線蟲(Trichinella spiralis)引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患線蟲病。宿主通過攝入含有感染性肌幼蟲的肉而致病,富含旋毛蟲包囊的肉被哺乳動物吞食后,在胃酸的作用下,肌肉組織在胃內(nèi)消化,感染性肌幼蟲被釋放出來。旋毛蟲作為一種食源性病原體,其生活史決定了旋毛蟲肌幼蟲需經(jīng)過哺乳動物的胃這一極酸性環(huán)境進而導(dǎo)致宿主發(fā)病,但其是否存在與大腸桿菌相似的抗酸機制,現(xiàn)尚未見報道。已有研究結(jié)果證實,谷氨酸在旋毛蟲體內(nèi),尤其是肌幼蟲含量很高,并且旋毛蟲谷氨酸脫羧酶(GAD)基因序列已發(fā)表可查,所以我們推測旋毛蟲肌幼蟲中也可能具有類似的谷氨酸依賴型抗酸系統(tǒng)。本文根據(jù)GenBank上TsGAD的基因編碼序列設(shè)計帶有酶切位點的特異性引物,提取旋毛蟲肌幼蟲總RNA,采用RT-PCR方法得到c DNA后,以c DNA作為模板進行PCR擴增,然后將PCR產(chǎn)物與p MD18-T載體連接后轉(zhuǎn)入克隆感受態(tài)DH5α,經(jīng)過PCR和Hind III、Bam HⅠ雙酶切、測序后,將鑒定正確的目的片段與表達載體pET-30a(+)連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,利用誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)蛋白表達,通過對誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化,采用1mol/L IPTG,于37°C誘導(dǎo)5h是表達效果最為理想的條件,經(jīng)SDS-PAGE分析目的蛋白出現(xiàn)于57k Da左右,目的蛋白主要以包涵體形式存在,分子量約為57KDa,與預(yù)測的理論值相符。實驗采用比色法測定TsGAD重組蛋白活性,結(jié)果顯示TsGAD具有酶活性,活性大小為1.5U,說明通過復(fù)性得到正確折疊結(jié)構(gòu)的Ts GAD蛋白。將純化的重組蛋白多位點免疫新西蘭大白兔,制備多克隆抗體,獲得免疫多抗血清,用Western Blot方法對免疫原性進行分析,結(jié)果顯示,多克隆抗血清作為抗體可以識別重組蛋白并與之結(jié)合。利用間接ELISA方法檢測獲得的多抗效價,結(jié)果表明,獲得的多抗效價達到1:65536,該重組蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性,并且特異性高;免疫熒光定位試驗結(jié)果證明,Ts GAD分布于旋毛蟲肌幼蟲蟲體體表。根據(jù)Gen Bank中發(fā)表的旋毛蟲的TsGAD和TsGAPDH基因序列,設(shè)計實時熒光引物,建立熒光定量PCR檢測方法。利用建立的Ts GAD實時熒光PCR檢測方法,將p H設(shè)置4個梯度,分別為p H 2.5、pH 4.0、pH 6.6和p H 9.0,為了檢測不同p H條件下培養(yǎng)的旋毛蟲肌幼蟲Ts GAD m RNA的表達水平。研究結(jié)果顯示,隨著pH值的降低,Ts GAD mRNA表達量逐漸升高,在p H 2.5時Ts GAD mRNA表達量顯著高于pH 4.0、p H 6.6和p H 9.0(p0.05);同樣將培養(yǎng)時間設(shè)置3個梯度,分別是0.5h、1h和3h,此時Ts GAD的mRNA相對表達量也不同,培養(yǎng)1h的表達量高于培養(yǎng)0.5h和3h。研究結(jié)果表明,極酸環(huán)境能顯著誘導(dǎo)Ts GAD mRNA的表達,我們推測Ts GAD在酸性條件下具有抗酸性,TsGAD可能參與旋毛蟲與宿主之間的抗酸過程,這為進一步研究旋毛蟲的谷氨酸依賴型抗酸機理提供依據(jù),還為以后預(yù)防、治療及診斷旋毛蟲病奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：旋毛蟲肌幼蟲 谷氨酸脫羧酶(GAD) 原核表達 抗酸性 實時熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7
【目錄】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 引言11-18
• 1.1 旋毛蟲病及旋毛蟲生活史11
• 1.2 谷氨酸脫羧酶概況11-13
• 1.2.1 GAD的來源及用途11-12
• 1.2.2 GAD的酶學(xué)性質(zhì)12
• 1.2.3 GAD的分子生物學(xué)研究12-13
• 1.2.4 GAD酶活力的測定13
• 1.3 γ-氨基丁酸（GABA）13
• 1.3.1 GABA理化性質(zhì)及應(yīng)用13
• 1.3.2 GABA的制備13
• 1.4 常見胃腸道致病菌抗酸機制的研究進展13-17
• 1.4.1 大腸桿菌的抗酸機制14-15
• 1.4.2 沙門氏菌的抗酸機制15-16
• 1.4.3 志賀式桿菌的抗酸機制16
• 1.4.4 弧菌的抗酸機制16
• 1.4.5 乳酸乳球菌的抗酸機制16-17
• 1.4.6 單增李斯特菌的抗酸機制17
• 1.5 研究的目的和意義17-18
• 2 材料與方法18-29
• 2.1 材料18-19
• 2.1.1 蟲株18
• 2.1.2 主要試劑18
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備18-19
• 2.1.4 主要應(yīng)用軟件19
• 2.2 方法19-29
• 2.2.1 旋毛蟲肌幼蟲的收集19
• 2.2.2 引物設(shè)計與合成19
• 2.2.3 總RNA的提取19
• 2.2.4 逆轉(zhuǎn)錄19-20
• 2.2.5 TsGAD基因的克隆20-22
• 2.2.6 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建22-23
• 2.2.7 TsGAD重組蛋白的誘導(dǎo)表達23-24
• 2.2.8 比色法測定酶活性24
• 2.2.9 TsGAD蛋白的抗原性檢測24-25
• 2.2.10 TsGAD蛋白熒光免疫定位25-26
• 2.2.11 pH對旋毛蟲肌幼蟲TsGAD mRNA表達水平的影響26-28
• 2.2.12 肌幼蟲體外存活率的檢測28-29
• 3 結(jié)果29-41
• 3.1 TsGAD基因克隆結(jié)果29
• 3.1.1 旋毛蟲肌幼蟲TsGAD擴增29
• 3.1.2 重組克隆質(zhì)粒p MD18-T-Ts GAD的鑒定29
• 3.2 誘導(dǎo)表達結(jié)果29-32
• 3.2.1 重組質(zhì)粒pET-30a-Ts GAD的鑒定29-30
• 3.2.2 重組蛋白表達時相及可溶性分析30-31
• 3.2.3 pET-30a-GAD重組蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化31-32
• 3.3 TsGAD酶活性的檢測32-33
• 3.4 多克隆抗體效價的測定33
• 3.5 重組蛋白Western Blot檢測結(jié)果33-34
• 3.6 TsGAD蛋白熒光免疫定位34
• 3.7 不同pH對旋毛蟲肌幼蟲TsGAD mRNA表達水平的影響34-41
• 3.7.1 RT-TsGAD基因和內(nèi)參RT-Ts GAPDH基因片段的擴增34
• 3.7.2 標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建34-36
• 3.7.3 RT-TsGAD、RT-TsGAPDH熒光定量PCR檢測方法的建立36-38
• 3.7.4 pH對TsGAD mRNA表達水平的影響38
• 3.7.5 培養(yǎng)時間對TsGAD mRNA表達水平的影響38
• 3.7.6 肌幼蟲存活率的檢測38-41
• 4 討論41-44
• 4.1 TsGAD基因的原核表達41
• 4.2 TsGAD酶活性的測定及免疫相關(guān)性的分析41
• 4.3 不同pH對旋毛蟲肌幼蟲TsGAD mRNA表達水平的影響41-43
• 4.4 本實驗的創(chuàng)新之處43-44
• 5 結(jié)論44-45
• 致謝45-46
• 參考文獻46-51
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文51

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本文編號：929562