發(fā)布時間：2017-09-27 01:17

  本文關(guān)鍵詞：順鉑誘導(dǎo)體外犬乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡及相關(guān)凋亡因子研究

  更多相關(guān)文章： 犬乳腺腫瘤細(xì)胞 體外培養(yǎng) 細(xì)胞凋亡 凋亡相關(guān)因子

【摘要】：犬乳腺腫瘤是目前獸醫(yī)臨床上常見的疾病之一,對該疾病的防治一直是寵物醫(yī)生密切關(guān)注的問題。由于犬乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展與人類乳腺腫瘤具有很多相似之處,又可將其作為人乳腺腫瘤的優(yōu)良模型,來研究抗癌藥物的開發(fā)。順鉑是治療多種腫瘤的一線化療藥物,它的廣譜抗癌作用一直受到人們的好評,臨床上用于卵巢癌、前列腺癌、肺癌及成骨肉瘤等多種實力腫瘤均有很好的療效。而順鉑在犬乳腺腫瘤方面的研究國內(nèi)外文獻(xiàn)較少,且順鉑誘導(dǎo)犬乳腺腫瘤的抗癌機(jī)制也未見報道。本實驗探究順鉑誘導(dǎo)犬乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡及其對相關(guān)凋亡因子影響,對今后犬乳腺腫瘤的臨床治療與方案制定有著重要意義,也為人乳腺腫瘤的研究提供理論依據(jù)。實驗采用體外培養(yǎng)犬乳腺腫瘤細(xì)胞系CHMp(原發(fā)灶細(xì)胞)和CHMm(轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞)作為模型,經(jīng)不同濃度順鉑2.5μmol/L,5.0μmol/L和10μmol/L處理后培養(yǎng)12h,24h和48h,用倒置顯微鏡觀察和記錄細(xì)胞增殖與生長形態(tài),通過MTT法檢測順鉑對CHMm/CHMp的IC50值與細(xì)胞毒性實驗,同時用流式細(xì)胞儀檢測分析CHMm/CHMp的凋亡變化與周期阻滯影響,最后采用熒光定量PCR和Western Blot分別檢測CHMm/CHMp中凋亡相關(guān)因子AKT,,Bcl-2,NFκB的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)。將實驗數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS19.0軟件中統(tǒng)計分析得到實驗結(jié)果。結(jié)果表明:(1)MTT法檢測CHMm與CHMp的IC50值分別為4.86μmol/L和5.58μmol/L。且同一時間點對照組和藥物處理組比較差異極顯著(p0.01),而同一濃度下各實驗組組間差異也極顯著(p0.01),隨著順鉑濃度的增加,作用時間的延長,兩細(xì)胞系的抑制率逐漸上升,存在濃度-時間雙重依賴性。(2)顯微鏡下觀察CHMm與CHMp對照組細(xì)胞貼壁生長,輪廓清晰,界限明顯;順鉑作用劑量為5μmol/L,腫瘤細(xì)胞狀態(tài)實驗組與對照組相比胞體偏大,胞質(zhì)較透明,貼壁能力強(qiáng);順鉑作用劑量為10μmol/L時,實驗組細(xì)胞明顯變圓,胞質(zhì)渾濁,折光性差,在高倍鏡下觀察可看到黑色顆粒物增多。(3)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡顯示,各實驗組差異顯著(p0.05),隨順鉑濃度增加,CHMm/CHMp細(xì)胞團(tuán)均上移,凋亡細(xì)胞逐漸增加,細(xì)胞的抑制率隨之增加。檢測細(xì)胞周期顯示,CHMm/CHMp隨著順鉑濃度的增加,G1期比率差異不顯著(p0.05),S期比率顯著上升(P0.01),G2期比率逐漸下降(p0.05)。表明順鉑同樣能夠抑制腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂,阻滯細(xì)胞于S期。(4)熒光定量PCR檢測凋亡因子基因表達(dá)顯示,CHMm/CHMp對照組與各實驗組差異極顯著(p0.01),同一濃度順鉑作用下,各時間組組間差異顯著(p0.05)。隨著作用時間延長,對照組AKT、Nfκb和bcl-2基因表達(dá)均呈上升趨勢,而實驗組中隨順鉑濃度增加,Bcl-2和AKT基因表達(dá)明顯逐漸下降,Nfκb基因表達(dá)卻顯著增高。且CHMm與CHMp中AKT、NFκb和Bcl-2基因表達(dá)含量存在差異。(5)Western Blot檢測凋亡因子蛋白表達(dá)證明,同一作用時間點24h時,Akt和bcl-2的蛋白表達(dá)含量隨著順鉑濃度的增加而逐漸減少,Nfκb的蛋白含量隨之逐漸增加。相同順鉑濃度為5μmol/L時,Akt和bcl-2的蛋白表達(dá)量隨作用時間的延長而逐漸減少,Nfκb的蛋白含量隨之逐漸增加。通過實驗得出以下結(jié)論:順鉑對犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMm/CHMp均有抑制作用,且存在時間-濃度依賴性。CHMm的IC50為4.86μmol/L,CHMp的IC50為5.58μmol/L;顯微鏡下觀察順鉑能夠誘導(dǎo)犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMm/CHMp細(xì)胞凋亡;順鉑對CHMm/CHMp的S期有阻滯作用;CHMm和CHMp細(xì)胞內(nèi)AKT、BCL-2和NFκB基因和蛋白表達(dá)都不同,順鉑能下調(diào)AKT、Bcl-2基因和蛋白表達(dá),上調(diào)NFκB基因和蛋白表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：犬乳腺腫瘤細(xì)胞 體外培養(yǎng) 細(xì)胞凋亡 凋亡相關(guān)因子
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.292
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 引言12-18
• 1.1 犬乳腺腫瘤及其研究進(jìn)展12
• 1.2 腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)12-13
• 1.3 腫瘤細(xì)胞凋亡及研究進(jìn)展13
• 1.4 細(xì)胞凋亡途徑13-14
• 1.5 Akt、NF-kB、Bcl-2 與腫瘤的關(guān)系研究現(xiàn)狀14-16
• 1.6 順鉑藥物及研究發(fā)展16-17
• 1.7 研究目的和意義17-18
• 2 材料與方法18-27
• 2.1 材料18-21
• 2.1.1 細(xì)胞系18
• 2.1.2 主要儀器18
• 2.1.3 主要試劑18-19
• 2.1.4 主要試劑的配制19-21
• 2.2 實驗方法21-27
• 2.2.1 犬乳腺腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)21
• 2.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活力21-22
• 2.2.3 不同濃度順鉑對犬乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡檢測22
• 2.2.4 不同濃度順鉑對犬乳腺腫瘤細(xì)胞周期檢測22
• 2.2.5 熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)因子22-24
• 2.2.6 Western Blot檢測凋亡相關(guān)因子24-26
• 2.2.7 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析26-27
• 3 實驗結(jié)果27-43
• 3.1 順鉑對犬乳腺腫瘤細(xì)胞體外增值抑制檢測27-30
• 3.1.1 MTT法犬乳腺腫瘤細(xì)胞IC50值檢測27-28
• 3.1.2 MTT比色法檢測順鉑對CHMm和CHMp腫瘤細(xì)胞活性影響28-30
• 3.2 順鉑誘導(dǎo)犬乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡的檢測30-37
• 3.2.1 犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMm形態(tài)學(xué)觀察30-31
• 3.2.2 犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp形態(tài)學(xué)觀察31-32
• 3.2.3 順鉑作用后CHMm流式細(xì)胞凋亡檢測32-33
• 3.2.4 順鉑作用后CHMp細(xì)胞流式細(xì)胞凋亡檢測33-35
• 3.2.5 CHMm流式細(xì)胞周期檢測35-36
• 3.2.6 CHMp流式細(xì)胞周期檢測36-37
• 3.3 順鉑對犬乳腺腫瘤中Akt、Nfκb、bcl-2 基因表達(dá)影響37-41
• 3.3.1 順鉑對CHMm中Akt、Nfκb、bcl-2 基因表達(dá)影響37-39
• 3.3.2 順鉑對CHMp中Akt、Nfκb、bcl-2 基因表達(dá)影響39-41
• 3.4 順鉑作用后犬乳腺腫瘤中Akt、Nfκb、bcl-2 蛋白表達(dá)檢測41-43
• 4 討論43-48
• 4.1 順鉑對犬乳腺腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用43
• 4.2 順鉑對犬乳腺腫瘤細(xì)胞的形態(tài)影響43-44
• 4.3 順鉑對犬乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡和周期的影響44-45
• 4.4 順鉑對乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的影響45-48
• 5 結(jié)論48-49
• 致謝49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文56

【相似文獻(xiàn)】

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3 記者 熊燕;樹，

本文編號：926829