本文關鍵詞：順鉑誘導體外犬乳腺腫瘤細胞凋亡及相關凋亡因子研究

  更多相關文章： 犬乳腺腫瘤細胞 體外培養(yǎng) 細胞凋亡 凋亡相關因子

【摘要】：犬乳腺腫瘤是目前獸醫(yī)臨床上常見的疾病之一,對該疾病的防治一直是寵物醫(yī)生密切關注的問題。由于犬乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展與人類乳腺腫瘤具有很多相似之處,又可將其作為人乳腺腫瘤的優(yōu)良模型,來研究抗癌藥物的開發(fā)。順鉑是治療多種腫瘤的一線化療藥物,它的廣譜抗癌作用一直受到人們的好評,臨床上用于卵巢癌、前列腺癌、肺癌及成骨肉瘤等多種實力腫瘤均有很好的療效。而順鉑在犬乳腺腫瘤方面的研究國內外文獻較少,且順鉑誘導犬乳腺腫瘤的抗癌機制也未見報道。本實驗探究順鉑誘導犬乳腺腫瘤細胞凋亡及其對相關凋亡因子影響,對今后犬乳腺腫瘤的臨床治療與方案制定有著重要意義,也為人乳腺腫瘤的研究提供理論依據。實驗采用體外培養(yǎng)犬乳腺腫瘤細胞系CHMp(原發(fā)灶細胞)和CHMm(轉移灶細胞)作為模型,經不同濃度順鉑2.5μmol/L,5.0μmol/L和10μmol/L處理后培養(yǎng)12h,24h和48h,用倒置顯微鏡觀察和記錄細胞增殖與生長形態(tài),通過MTT法檢測順鉑對CHMm/CHMp的IC50值與細胞毒性實驗,同時用流式細胞儀檢測分析CHMm/CHMp的凋亡變化與周期阻滯影響,最后采用熒光定量PCR和Western Blot分別檢測CHMm/CHMp中凋亡相關因子AKT,,Bcl-2,NFκB的基因表達和蛋白表達。將實驗數(shù)據導入SPSS19.0軟件中統(tǒng)計分析得到實驗結果。結果表明:(1)MTT法檢測CHMm與CHMp的IC50值分別為4.86μmol/L和5.58μmol/L。且同一時間點對照組和藥物處理組比較差異極顯著(p0.01),而同一濃度下各實驗組組間差異也極顯著(p0.01),隨著順鉑濃度的增加,作用時間的延長,兩細胞系的抑制率逐漸上升,存在濃度-時間雙重依賴性。(2)顯微鏡下觀察CHMm與CHMp對照組細胞貼壁生長,輪廓清晰,界限明顯;順鉑作用劑量為5μmol/L,腫瘤細胞狀態(tài)實驗組與對照組相比胞體偏大,胞質較透明,貼壁能力強;順鉑作用劑量為10μmol/L時,實驗組細胞明顯變圓,胞質渾濁,折光性差,在高倍鏡下觀察可看到黑色顆粒物增多。(3)流式細胞儀檢測細胞凋亡顯示,各實驗組差異顯著(p0.05),隨順鉑濃度增加,CHMm/CHMp細胞團均上移,凋亡細胞逐漸增加,細胞的抑制率隨之增加。檢測細胞周期顯示,CHMm/CHMp隨著順鉑濃度的增加,G1期比率差異不顯著(p0.05),S期比率顯著上升(P0.01),G2期比率逐漸下降(p0.05)。表明順鉑同樣能夠抑制腫瘤細胞進行有絲分裂,阻滯細胞于S期。(4)熒光定量PCR檢測凋亡因子基因表達顯示,CHMm/CHMp對照組與各實驗組差異極顯著(p0.01),同一濃度順鉑作用下,各時間組組間差異顯著(p0.05)。隨著作用時間延長,對照組AKT、Nfκb和bcl-2基因表達均呈上升趨勢,而實驗組中隨順鉑濃度增加,Bcl-2和AKT基因表達明顯逐漸下降,Nfκb基因表達卻顯著增高。且CHMm與CHMp中AKT、NFκb和Bcl-2基因表達含量存在差異。(5)Western Blot檢測凋亡因子蛋白表達證明,同一作用時間點24h時,Akt和bcl-2的蛋白表達含量隨著順鉑濃度的增加而逐漸減少,Nfκb的蛋白含量隨之逐漸增加。相同順鉑濃度為5μmol/L時,Akt和bcl-2的蛋白表達量隨作用時間的延長而逐漸減少,Nfκb的蛋白含量隨之逐漸增加。通過實驗得出以下結論:順鉑對犬乳腺腫瘤細胞CHMm/CHMp均有抑制作用,且存在時間-濃度依賴性。CHMm的IC50為4.86μmol/L,CHMp的IC50為5.58μmol/L;顯微鏡下觀察順鉑能夠誘導犬乳腺腫瘤細胞CHMm/CHMp細胞凋亡;順鉑對CHMm/CHMp的S期有阻滯作用;CHMm和CHMp細胞內AKT、BCL-2和NFκB基因和蛋白表達都不同,順鉑能下調AKT、Bcl-2基因和蛋白表達,上調NFκB基因和蛋白表達。
【關鍵詞】：犬乳腺腫瘤細胞 體外培養(yǎng) 細胞凋亡 凋亡相關因子
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.292
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 引言12-18
• 1.1 犬乳腺腫瘤及其研究進展12
• 1.2 腫瘤細胞的體外培養(yǎng)12-13
• 1.3 腫瘤細胞凋亡及研究進展13
• 1.4 細胞凋亡途徑13-14
• 1.5 Akt、NF-kB、Bcl-2 與腫瘤的關系研究現(xiàn)狀14-16
• 1.6 順鉑藥物及研究發(fā)展16-17
• 1.7 研究目的和意義17-18
• 2 材料與方法18-27
• 2.1 材料18-21
• 2.1.1 細胞系18
• 2.1.2 主要儀器18
• 2.1.3 主要試劑18-19
• 2.1.4 主要試劑的配制19-21
• 2.2 實驗方法21-27
• 2.2.1 犬乳腺腫瘤細胞的體外培養(yǎng)21
• 2.2.2 MTT法檢測細胞活力21-22
• 2.2.3 不同濃度順鉑對犬乳腺腫瘤細胞凋亡檢測22
• 2.2.4 不同濃度順鉑對犬乳腺腫瘤細胞周期檢測22
• 2.2.5 熒光定量PCR檢測凋亡相關因子22-24
• 2.2.6 Western Blot檢測凋亡相關因子24-26
• 2.2.7 實驗數(shù)據統(tǒng)計與分析26-27
• 3 實驗結果27-43
• 3.1 順鉑對犬乳腺腫瘤細胞體外增值抑制檢測27-30
• 3.1.1 MTT法犬乳腺腫瘤細胞IC50值檢測27-28
• 3.1.2 MTT比色法檢測順鉑對CHMm和CHMp腫瘤細胞活性影響28-30
• 3.2 順鉑誘導犬乳腺腫瘤細胞凋亡的檢測30-37
• 3.2.1 犬乳腺腫瘤細胞CHMm形態(tài)學觀察30-31
• 3.2.2 犬乳腺腫瘤細胞CHMp形態(tài)學觀察31-32
• 3.2.3 順鉑作用后CHMm流式細胞凋亡檢測32-33
• 3.2.4 順鉑作用后CHMp細胞流式細胞凋亡檢測33-35
• 3.2.5 CHMm流式細胞周期檢測35-36
• 3.2.6 CHMp流式細胞周期檢測36-37
• 3.3 順鉑對犬乳腺腫瘤中Akt、Nfκb、bcl-2 基因表達影響37-41
• 3.3.1 順鉑對CHMm中Akt、Nfκb、bcl-2 基因表達影響37-39
• 3.3.2 順鉑對CHMp中Akt、Nfκb、bcl-2 基因表達影響39-41
• 3.4 順鉑作用后犬乳腺腫瘤中Akt、Nfκb、bcl-2 蛋白表達檢測41-43
• 4 討論43-48
• 4.1 順鉑對犬乳腺腫瘤細胞的細胞毒性作用43
• 4.2 順鉑對犬乳腺腫瘤細胞的形態(tài)影響43-44
• 4.3 順鉑對犬乳腺腫瘤細胞凋亡和周期的影響44-45
• 4.4 順鉑對乳腺腫瘤細胞凋亡相關因子的影響45-48
• 5 結論48-49
• 致謝49-50
• 參考文獻50-56
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文56

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3 記者 熊燕;樹，

本文編號：926829