本文關(guān)鍵詞：偽狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析及gE缺失轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建

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【摘要】：偽狂犬病病毒(Pseudorabies viurs,PRV)屬皰疹病毒科(Herpesviridae)、α-皰疹病毒亞科(Alpha-herpesviridae),可致多數(shù)動(dòng)物感染發(fā)病,并能引起豬的潛伏感染。豬是其主要宿主和病毒攜帶者,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展危害重大。在2011年之前,由于PRV gE缺失疫苗的廣泛使用,國(guó)內(nèi)的PRV疫情得到了很好的控制,但從2011年底開(kāi)始,PRV疫情突然大面積爆發(fā),傳統(tǒng)的gE缺失疫苗已被證實(shí)無(wú)法提供完全有效的免疫保護(hù),使得國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)面臨巨大的威脅。本研究對(duì)PRV新流行毒株進(jìn)行了分離鑒定,并對(duì)其主要糖蛋白的分子特征進(jìn)行了分析;模仿PRV Bartha株的gE缺失區(qū)域,構(gòu)建了PRV新流行毒株的gE缺失轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,為新流行毒株gE缺失突變株的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下:1、偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定從安徽某免疫PRV Bartha K61疫苗豬場(chǎng)送檢的流產(chǎn)胎兒中采集腦、心、肝、脾、肺、腎,經(jīng)PCR擴(kuò)增,結(jié)果從腦、肝、脾、肺中檢測(cè)到PRV gE基因陽(yáng)性。將腦組織研磨后接種BHK-21細(xì)胞,在37℃5%CO_2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后,細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變,病變細(xì)胞經(jīng)PCR檢測(cè)為PRV gE陽(yáng)性;采用空斑純化方法純化了該病毒,并命名為PRV AH-China-2013。將病毒接種昆明小鼠,通過(guò)LD_(50)測(cè)定評(píng)價(jià)了該病毒對(duì)小鼠的致病性,結(jié)果表明其LD_(50)為10~(4.15)TCID_(50)。2、偽狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析提取PRV AH-China-2013基因組,采用PCR擴(kuò)增其主要糖蛋白基因g B、g C、g D、gE,經(jīng)測(cè)序后,將g C、gE基因分別與國(guó)內(nèi)外不同年代分離的PRV毒株進(jìn)行序列比對(duì),通過(guò)mega5.0繪制PRV AH-China-2013株g C和gE基因的遺傳進(jìn)化樹(shù);通過(guò)PRV AH-China-2013 g B、g C、g D、gE序列推導(dǎo)其氨基酸序列,并與國(guó)內(nèi)外不同年代分離的PRV毒株相應(yīng)糖蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示,PRV AH-China-2013株與國(guó)內(nèi)毒株(除2008年分離的7株毒株外)位于同一個(gè)分支,且與2011年來(lái)新分離毒株的遺傳關(guān)系更近,而與與國(guó)外毒株及疫苗毒株Bartha株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn),表明PRV AH-China-2013株屬于PRV新流行毒株。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,與國(guó)外毒株相比,國(guó)內(nèi)株主要糖蛋白均存在明顯的氨基酸的缺失或插入,且部分突變位點(diǎn)位于相應(yīng)蛋白的關(guān)鍵功能域內(nèi),這些突變是否導(dǎo)致病毒毒力及免疫原性的改變,進(jìn)而影響現(xiàn)有疫苗的免疫效果,尚需進(jìn)一步證實(shí)。3、偽狂犬病病毒新流行株gE缺失轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)新流行毒株P(guān)RV-ZJ01的基因組序列,在gE基因上、下游設(shè)計(jì)長(zhǎng)度分別為838bp和961bp的基因片段作為同源重組的同源臂,即同源左臂LA和同源右臂RA;以p EGFP質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增包含完整表達(dá)盒的綠色熒光蛋白基因EGFP作為標(biāo)記基因。通過(guò)酶切、連接、轉(zhuǎn)化等方法,并按照LA-EGFP-RA的順序,將LA、RA、EGFP連接到T載體的多克隆位點(diǎn),構(gòu)建PRV gE缺失轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為p MD-LA-EGFP-RA。將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒p MD-LA-EGFP-RA轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,通過(guò)熒光顯微鏡觀察,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞中可觀察到綠色熒光蛋白EGFP的表達(dá),表明構(gòu)建的轉(zhuǎn)移質(zhì)�？梢杂糜诤罄m(xù)同源重組試驗(yàn)。本研究從分子水平上解析了PRV新流行株與疫苗株Bartha株主要糖蛋白的遺傳差異,為進(jìn)一步深入研究Bartha株疫苗免疫失敗的原因提供了理論依據(jù);成功構(gòu)建了PRV新流行株的gE缺失轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,為gE缺失突變株的構(gòu)建及新疫苗的研制奠定了一定的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：偽狂犬病病毒 流行毒株 主要糖蛋白 分子特征分析 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 1 前言11-19
• 1.1 偽狂犬病的流行病學(xué)11
• 1.2 我國(guó)偽狂犬病的流行現(xiàn)狀11-12
• 1.3 病原學(xué)12
• 1.3.1 病毒的結(jié)構(gòu)12
• 1.3.2 病毒的理化特性12
• 1.4 病毒的傳染特點(diǎn)12-13
• 1.4.1 潛伏感染12
• 1.4.2 隱性感染12-13
• 1.4.3 顯性感染13
• 1.5 偽狂犬病毒的致病機(jī)理13
• 1.6 偽狂犬病的診斷方法13-15
• 1.6.1 動(dòng)物接種試驗(yàn)13-14
• 1.6.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)14
• 1.6.3 免疫熒光試驗(yàn)(FA)14
• 1.6.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）14-15
• 1.6.5 基因芯片技術(shù)15
• 1.7 偽狂犬病的防控15-16
• 1.7.1 自繁自養(yǎng)15
• 1.7.2 疫苗免疫15-16
• 1.7.3 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理16
• 1.8 病毒重組涉及的研究方法16-18
• 1.8.1 同源重組技術(shù)16-17
• 1.8.2 融合PCR技術(shù)17
• 1.8.3 外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞技術(shù)17-18
• 1.8.4 病毒空斑技術(shù)18
• 1.9 研究的目的和意義18-19
• 2 材料與方法19-37
• 2.1 材料19-21
• 2.1.1 細(xì)胞、菌種、質(zhì)粒和動(dòng)物19
• 2.1.2 酶類(lèi)相關(guān)試劑19
• 2.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)用溶液19-20
• 2.1.4 病毒DNA抽提相關(guān)溶液20
• 2.1.5 細(xì)菌培養(yǎng)基及常用溶液20
• 2.1.6 瓊脂糖凝膠電泳緩沖液20
• 2.1.7 主要儀器設(shè)備20-21
• 2.2 方法21-37
• 2.2.1 PRV AH-China-2013的分離與鑒定21-23
• 2.2.2 PRV AH-China-2013株的空斑純化與TCID_(50)的測(cè)定23-24
• 2.2.3 PRV AH-China-2013的致病性實(shí)驗(yàn)24
• 2.2.4 PRV AH-China-2013主要糖蛋白基因片段的克隆與鑒定24-26
• 2.2.5 PRV AH-China-2013主要糖蛋白基因序列測(cè)序結(jié)果的分析26
• 2.2.6 PRV AH-China-2013 gE缺失轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建26-27
• 2.2.7 綠色熒光蛋白基因EGFP的PCR擴(kuò)增27-28
• 2.2.8 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-LA-EGFP-RA的構(gòu)建與表達(dá)28-31
• 2.2.9 重組質(zhì)粒pMD-LA-RA的構(gòu)建31-33
• 2.2.10 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-LA-EGFP-RA的構(gòu)建33-35
• 2.2.11 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-LA-EGFP-RA基因的表達(dá)檢測(cè)35-37
• 3 結(jié)果與分析37-53
• 3.1 PRV的分離與鑒定37-39
• 3.1.1 疑似病料的PCR擴(kuò)增結(jié)果37
• 3.1.2 病料接種細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞病變37-38
• 3.1.3 病變細(xì)胞的PCR檢測(cè)38-39
• 3.2 PRV的空斑純化與致病性實(shí)驗(yàn)39-41
• 3.2.1 PRV的空斑純化39
• 3.2.2 PRV AH-China-2013 TCID_(50)的測(cè)定39-40
• 3.2.3 PRV AH-China-2013的致病性實(shí)驗(yàn)40-41
• 3.3 PRV AH-China-2013的遺傳進(jìn)化與分子特征分析41-49
• 3.3.1 PRV AH-China-2013主要糖蛋白基因的PCR擴(kuò)增41-43
• 3.3.2 PRV AH-China-2013的遺傳進(jìn)化分析43-46
• 3.3.3 PRV AH-China-2013主要糖蛋白的分子特征分析46-49
• 3.4 PRV AH-China-2013 gE缺失轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建49-53
• 3.4.1 同源臂LA和RA的PCR擴(kuò)增結(jié)果49-50
• 3.4.2 EGFP基因表達(dá)盒的PCR擴(kuò)增結(jié)果50-51
• 3.4.3 重組質(zhì)粒pMD-LA的酶切鑒定結(jié)果51
• 3.4.4 重組質(zhì)粒pMD-LA-RA的酶切鑒定結(jié)果51-52
• 3.4.5 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-LA-EGFP-RA的酶切鑒定結(jié)果52-53
• 3.4.6 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-LA-EGFP-RA中EGFP基因的表達(dá)檢測(cè)53
• 4 討論與結(jié)論53-59
• 4.1 討論53-57
• 4.1.1 我國(guó)豬偽狂犬病的流行趨勢(shì)53-54
• 4.1.2 PRV Bartha-K61疫苗免疫失敗的原因分析54-55
• 4.1.3 PRV AH-China-2013主要糖蛋白的突變分析55-57
• 4.1.4 偽狂犬病病毒新流行毒株基因缺失疫苗的研究策略57
• 4.2 結(jié)論57-59
• 致謝59-60
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 附錄A：熒光質(zhì)粒pEGFP-N1的圖譜63-64
• 附錄B：pMD18-T質(zhì)粒圖譜64-65
• 附錄C：PRV-AH株gB、gC、gD、gE糖蛋白的基因序列65-69

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本文編號(hào)：926554