本文關(guān)鍵詞：水貂腸炎細(xì)小病毒在體內(nèi)分布規(guī)律及相關(guān)細(xì)胞因子的變化

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【摘要】：水貂病毒性腸炎(Mink parvoviral enteritis),是由水貂腸炎細(xì)小病毒(Mink enteritis virus MEV)引起的高度接觸性傳染病,發(fā)病水貂的主要臨床特征為劇烈腹瀉和嘔吐等,該病具有較高的發(fā)病率和死亡率。隨著毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展,此病也時(shí)常爆發(fā),給水貂養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此研究水貂腸炎病毒的致病性和免疫相關(guān)因子變化對(duì)MEV的預(yù)防具有重要作用。為檢測(cè)水貂IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA,建立了熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法,根據(jù)GenBank設(shè)計(jì)引物,通過RT-PCR擴(kuò)增IFN-α、IFN-β、IFN-γ和GAPDH基因片段,連接到pMD18-T載體中制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,建立了相應(yīng)基因mRNA的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:GAPDH、IFN-α和IFN-β和IFN-γ基因的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度在1×101copies/μL~1×107copies/μL內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)均為1.00,熔解曲線均呈單一熔解峰,檢測(cè)下限為10copies/μL,重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明組內(nèi)、組間變異系數(shù)均小于4.5%。臨床樣品檢測(cè)結(jié)果表明水貂感染腸炎病毒后,IFN-α、IFN-β和IFNγ相對(duì)表達(dá)水平均在6d達(dá)到最高峰值,IFN-α相對(duì)表達(dá)量要比IFN-β和IFN-γ相對(duì)表達(dá)量高,并且在感染期(4d~6d)IFN-α相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)。本研究為水貂IFN mRNA的定量分析提供了有效工具。為研究水貂腸炎病毒強(qiáng)毒株SMPV-11和弱毒疫苗株MEVB-F61分別感染水貂后,水貂細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化,現(xiàn)采用已建立并應(yīng)用的SYBR GreenⅠ染料法熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法,檢測(cè)不同MEV(SMPV-11和MEVB-F61)感染水貂后,水貂細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化。檢測(cè)結(jié)果表明:在感染SMPV-11和MEVB-F61病毒后,IFN-α、IFN-β、INF-γ和IL-4相對(duì)表達(dá)量在2d~6d逐漸升高,并且在第6d達(dá)到峰值;并且IFN-α、IFN-β、INF-γ和IL-4在10d和15d SMPV-11組的表達(dá)量均高于MEVB-F61組;TNF-α的相對(duì)表達(dá)量與前三者有所差異,在0d~2d mRNA表達(dá)量逐漸升高,第2d達(dá)到最高值后逐漸下降,在第6d又開始逐漸升高,并且SMPV-11組的表達(dá)量也高于MEVB-F61組。本研究為MEV感染水貂后機(jī)體外周血細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)變化的研究提供理論基礎(chǔ)。為了研究水貂腸炎病毒感染水貂后病毒在水貂體內(nèi)的分布情況,設(shè)計(jì)了兩個(gè)試驗(yàn),首先研究水貂細(xì)小病毒強(qiáng)毒株SMPV-11口服感染水貂后的病理變化、白細(xì)胞變化和病毒在體內(nèi)不同器官分布情況等;同時(shí)另一個(gè)試驗(yàn)研究了弱毒疫苗株MEVB-F61注射感染水貂后的病毒在體內(nèi)不同器官分布規(guī)律、白細(xì)胞變化。結(jié)果表明,SMPV-11感染后,水貂表現(xiàn)出嚴(yán)重的臨床特征,如食欲廢絕、體溫升高及血便等癥狀,剖檢可見腸系膜淋巴結(jié)、脾臟和肝臟腫大有出血點(diǎn)、腸道出血和腸壁變薄等癥狀,感染24h后,在各組織臟器中可以檢測(cè)到病毒,并且在4d~6d MEV載量維持較高水平。MEVB-F61感染后,未發(fā)現(xiàn)主要的臨床癥狀,剖檢未見明顯的病理變化特征,病毒載量檢測(cè)顯示,在腦、腎臟和肺臟中未檢測(cè)到MEV的存在,而且在其它組織中,病毒載量均較低,在第15d心、肝和腸道等臟器中已檢測(cè)不到MEV。在4d~8d是SMPV-11組和MEVB-F61水貂的排毒量高峰時(shí)段,表明此時(shí)段是病毒向外界擴(kuò)散最嚴(yán)重時(shí)期,并且兩個(gè)毒株在腸道和淋巴組織和脾臟中含量最高,印證了腸道、腸系膜淋巴結(jié)和脾臟等是MEV主要的靶器官。對(duì)MEV在臨床特征、病理變化和病毒體內(nèi)分布的研究,有利于MEV感染水貂的致病機(jī)理的進(jìn)一步研究,也為MEV弱毒疫苗的免疫研究奠定理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：水貂腸炎病毒 細(xì)胞因子 白細(xì)胞介素 致病機(jī)理
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-16
• 第一章 引言16-24
• 1.1 水貂腸炎病毒概述16
• 1.1.1 水貂腸炎病毒病原學(xué)16
• 1.2 水貂腸炎病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展16-21
• 1.2.1 MEV的非結(jié)構(gòu)蛋白16-17
• 1.2.2 MEV的結(jié)構(gòu)蛋白17-18
• 1.2.3 MEV的治病機(jī)理18
• 1.2.4 MEV的診斷方法18-20
• 1.2.5 MEV疫苗研究進(jìn)展20-21
• 1.3 細(xì)胞因子的研究進(jìn)展21-23
• 1.3.1 干擾素抗病毒及免疫相關(guān)作用21-22
• 1.3.2 白細(xì)胞介素抗病毒及免疫相關(guān)作用22
• 1.3.3 腫瘤壞死因子抗病毒及免疫相關(guān)作用22-23
• 1.4 本研究的目的和意義23-24
• 第二章 水貂干擾素?zé)晒舛繖z測(cè)方法的建立及應(yīng)用24-33
• 2.1 材料與方法25-26
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和毒種25
• 2.1.2 主要試劑和儀器25
• 2.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成25
• 2.1.4 淋巴細(xì)胞總RNA提取與cDNA合成25-26
• 2.1.5 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備26
• 2.1.6 反應(yīng)條件優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立26
• 2.1.7 敏感性、重復(fù)性和特異性試驗(yàn)26
• 2.1.8 臨床樣品檢測(cè)26
• 2.2 結(jié)果26-31
• 2.2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備26-27
• 2.2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化27
• 2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作27-29
• 2.2.4 敏感性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)29-30
• 2.2.5 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果30-31
• 2.3 討論31-32
• 2.4 本章小結(jié)32-33
• 第三章 水貂細(xì)小病毒SMPV-11和MEVB-F61感染后細(xì)胞因子檢測(cè)33-40
• 3.1 材料與方法33-36
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和毒種33-34
• 3.1.2 主要試劑和儀器34
• 3.1.3 水貂腸炎病毒擴(kuò)增培養(yǎng)及病毒含量的測(cè)定34
• 3.1.4 雙陰性動(dòng)物的篩選34
• 3.1.5 動(dòng)物分組與攻毒34
• 3.1.6 引物合成34-35
• 3.1.7 血液RNA的提取與cDNA合成35
• 3.1.8 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備35
• 3.1.9 樣品采集與檢測(cè)35-36
• 3.2 結(jié)果36-38
• 3.2.1 TCID50測(cè)定及攻毒36
• 3.2.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備36
• 3.2.3 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果36-38
• 3.3 討論38-39
• 3.3.1 干擾素檢測(cè)結(jié)果38
• 3.3.2 白細(xì)胞介素檢測(cè)結(jié)果38
• 3.3.3 腫瘤壞死因子檢測(cè)結(jié)果38-39
• 3.4 本章小結(jié)39-40
• 第四章 水貂細(xì)小病毒（SMPV-11和MEVB-F61）感染后病毒體內(nèi)分布40-54
• 4.1 材料40-41
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和毒種40
• 4.1.2 主要試劑和儀器40-41
• 4.2 方法41-43
• 4.2.1 水貂腸炎病毒擴(kuò)增培養(yǎng)及病毒含量的測(cè)定41
• 4.2.2 雙陰性動(dòng)物篩選41
• 4.2.3 動(dòng)物分組和攻毒41
• 4.2.4 動(dòng)物體征觀察與樣品采集41-42
• 4.2.5 DNA的提取42
• 4.2.6 血清MEV抗體檢測(cè)42
• 4.2.7 血常規(guī)檢測(cè)42
• 4.2.8 病毒含量檢測(cè)42-43
• 4.3 結(jié)果43-52
• 4.3.1 動(dòng)物體征變化43
• 4.3.2 發(fā)病動(dòng)物剖檢43-44
• 4.3.3 病理切片44-48
• 4.3.4 MEV感染后體溫變化情況48
• 4.3.5 水貂抗體水平48-49
• 4.3.6 水貂組織和糞便中MEV含量測(cè)定49-51
• 4.3.7 血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果51-52
• 4.4 討論52-53
• 4.4.1 動(dòng)物的臨床特性及病理變化52
• 4.4.2 病毒載量和體內(nèi)分布52
• 4.4.3 血常規(guī)變化52-53
• 4.5 本章小結(jié)53-54
• 第五章 全文結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 附錄61-62
• 致謝62-63
• 作者簡(jiǎn)歷63

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本文編號(hào)：924501