本文關(guān)鍵詞：一株O60血清型鴨大腸埃希菌的分離鑒定及耐藥性分析

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【摘要】：禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸埃希菌(APEC)引起的,以大腸桿菌性肉芽腫、腹膜炎、輸卵管炎、心包炎,肝周炎為特征。大腸埃希菌有鞭毛,能運(yùn)動(dòng)、為中等大小的無芽孢的革蘭陰性桿菌。近年來關(guān)于禽大腸桿菌病的報(bào)道越來越多,禽大腸桿菌病發(fā)病率高,流行范圍廣,雖然病死率不高,但是對(duì)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的影響。引起禽大腸桿菌病的禽致病性大腸埃希菌血清型眾多且分布范圍廣,再加之我國養(yǎng)禽業(yè)基數(shù)大,飼養(yǎng)管理粗放,導(dǎo)致禽大腸桿菌病成為了養(yǎng)禽業(yè)的一種常發(fā)病。由于抗菌藥物的濫用,使得禽致病性大腸埃希菌的耐藥譜很廣,這對(duì)禽大腸桿菌病的防治造成了很大的影響。本研究從潼關(guān)縣某發(fā)病鴨場(chǎng)采集病料進(jìn)行病原的分離鑒定,并對(duì)其進(jìn)行耐藥性分析,為鴨大腸桿菌病的防制提供重要的理論依據(jù)。1.采集潼關(guān)縣某鴨場(chǎng)疑似禽大腸埃希菌感染的病鴨的病變組織進(jìn)行病原的分離鑒定,用無菌操作法將病變組織涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基與普通瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h,在普通瓊脂培養(yǎng)基上生成圓形凸起、半透明、淺灰色、濕潤的,光滑的菌落。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生成圓形凸起、濕潤的、光滑的,粉紅色的菌落。挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色并在顯微鏡下觀察到革蘭染色陰性的中等大小的無芽孢的桿菌。將分離菌的純培養(yǎng)物接種于普通瓊脂斜面培養(yǎng)基、鄧亨氏蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水,37℃培養(yǎng)24 h后,用接種環(huán)在普通瓊脂斜面挑取少量菌落接種于生化鑒定管內(nèi),37℃培養(yǎng)24 h,結(jié)果顯示,分離菌能發(fā)酵葡萄糖和乳糖、靛基質(zhì)陽性、MR陽性、VP陰性。將分離菌用細(xì)菌通用引物通過PCR進(jìn)行16S rRNA基因序列擴(kuò)增后,切下目的條帶并進(jìn)行回收,將膠回收PCR產(chǎn)物通過連接至pMD19-T克隆載體、轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)鑒定為陽性的單克隆進(jìn)行送測(cè)。測(cè)序結(jié)果顯示,該分離菌的16S rRNA基因片段大小為1534 bp,與大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株的基因序列的相似度為99%。綜合判定該分離株為大腸埃希菌,并命名為TG-2015。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明TG-2015分離株處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支。2.將分離菌的純培養(yǎng)物接種于普通瓊脂斜面,37℃培養(yǎng)24 h。用少量的5%石碳酸生理鹽水沖洗斜面,將洗下的懸液2000 r/min離心5 min。然后將上懸液放入另一離心管內(nèi),8000 r/min,離心10 min。棄去上懸液,將沉淀配制成菌懸液,121℃滅菌2 h,將K抗原破壞后所制備的抗原為O抗原。將不同型的抗“O”血清用無菌生理鹽水稀釋8倍后,分別滴加25μL于玻片上,再滴加25μL O抗原與之混合,30s內(nèi)出現(xiàn)凝集則為陽性,經(jīng)鑒定TG-2015的血清型為O60。3.將分離菌的純培養(yǎng)物接種于普通瓊脂斜面培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h,用生理鹽水配制成1×109CFU/mL的懸液。分別腹腔接種6只小白鼠和6只雛鴨,0.2 mL/只。用滅菌生理鹽水接種3只小鼠和3只雛鴨,作為陰性對(duì)照。在接種后24 h內(nèi),實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物全部死亡,對(duì)照組全部存活。結(jié)果表明分離株TG-2015具有較強(qiáng)的致病性。4.將分離菌的純培養(yǎng)物接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h后,在無菌操作臺(tái)中用挑菌環(huán)挑取典型的單菌落配制成1×108 CFU/mL~2×108 CFU/mL的菌液,用吸管吸取少量的菌液然后均勻的涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基上,將培養(yǎng)基放置5 min左右,然后用鑷子夾取藥敏紙片均勻的貼在培養(yǎng)基表面,每個(gè)MH瓊脂培養(yǎng)基貼4個(gè)藥敏紙片(共33個(gè)),將貼好的MH瓊脂培養(yǎng)基放置于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)16 h。結(jié)果表明TG-2015對(duì)試驗(yàn)所用的33種藥敏紙片中的25種耐藥,8種敏感。將對(duì)該分離株敏感的阿米卡星用于鴨場(chǎng)病鴨的治療,病鴨在用藥后7d康復(fù),產(chǎn)蛋率恢復(fù)正常。綜上所述,本研究所分離的鴨大腸埃希菌TG-2015的血清型O60在我國屬于不常見血清型,致病力強(qiáng),遺傳進(jìn)化處于單獨(dú)的分支,耐藥譜較為廣泛。
【關(guān)鍵詞】：鴨大腸埃希菌 分離鑒定 血清型 耐藥性
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 文獻(xiàn)綜述12-23
• 第一章 禽大腸桿菌病的研究進(jìn)展12-23
• 1.1 病原學(xué)12-13
• 1.1.1 形態(tài)特征12-13
• 1.1.2 培養(yǎng)特性13
• 1.1.3 分離鑒定13
• 1.1.4 抗原結(jié)構(gòu)與血清型13
• 1.1.5 大腸埃希菌生化特性13
• 1.1.6 抵抗力13
• 1.1.7 致病性13
• 1.2 流行病學(xué)13-14
• 1.2.1 傳染源14
• 1.2.2 傳播途徑14
• 1.2.3 易感動(dòng)物14
• 1.3 致病機(jī)理14
• 1.4 致病因子14-16
• 1.4.1 黏附素14-15
• 1.4.2 攝鐵系統(tǒng)(Fur)15
• 1.4.3 溶血素15
• 1.4.4 抗血清存活因子15-16
• 1.4.5 毒素16
• 1.5 臨床癥狀與病理變化16-17
• 1.5.1 臨床癥狀16-17
• 1.5.2 病理變化17
• 1.6 診斷17-18
• 1.6.1 病原學(xué)診斷17
• 1.6.2 血清型鑒定17-18
• 1.7 防治措施18-19
• 1.7.1 預(yù)防18
• 1.7.2 治療18-19
• 1.8 國內(nèi)不同地區(qū)血清型分布19
• 1.9 禽大腸埃希菌耐藥性研究進(jìn)展19-23
• 1.9.1 耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制19-20
• 1.9.2 耐藥性現(xiàn)狀20-21
• 1.9.3 研究耐藥性的意義21-23
• 試驗(yàn)研究23-36
• 第二章 鴨大腸埃希菌的分離鑒定及耐藥性分析23-36
• 2.1 材料23-24
• 2.1.1 病料23
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物23
• 2.1.3 主要試劑23-24
• 2.1.4 主要培養(yǎng)基24
• 2.1.5 常用培養(yǎng)基與試劑的配制24
• 2.1.6 引物24
• 2.1.7 主要儀器設(shè)備24
• 2.2 方法24-27
• 2.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)24
• 2.2.2 染色鏡檢24
• 2.2.3 生化試驗(yàn)24-25
• 2.2.4 血清型鑒定試驗(yàn)25
• 2.2.5 大腸埃希菌 16S rRNA基因的擴(kuò)增25
• 2.2.6 目的基因的克隆25-26
• 2.2.7 致病性試驗(yàn)26-27
• 2.2.8 藥敏試驗(yàn)27
• 2.3 結(jié)果27-33
• 2.3.1 分離培養(yǎng)27
• 2.3.2 分離菌株的染色鏡檢27-28
• 2.3.3 分離菌株的生化鑒定28-29
• 2.3.4 16S rRNA基因片段PCR擴(kuò)增29
• 2.3.5 測(cè)序29-30
• 2.3.6 遺傳進(jìn)化分析30
• 2.3.7 血清型鑒定試驗(yàn)30
• 2.3.8 動(dòng)物致病性試驗(yàn)30-31
• 2.3.9 藥敏試驗(yàn)31-33
• 2.4 討論33-35
• 2.4.1.關(guān)于病原菌的分離培養(yǎng)及鑒定33
• 2.4.2 血清型鑒定33-34
• 2.4.3 耐藥性分析34-35
• 2.5 小結(jié)35-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 附錄41-48
• 縮略詞表48-49
• 致謝49-50
• 作者簡(jiǎn)介50

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