本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)參與狂犬病病毒感染的胞內(nèi)體類型研究

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【摘要】：高度嗜神經(jīng)性的狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)是彈狀病毒科狂犬病病毒屬成員,能夠通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和p H依賴的內(nèi)吞途徑侵入神經(jīng)細(xì)胞,經(jīng)軸突運(yùn)輸?shù)竭_(dá)胞體。雖有研究表明RABV P蛋白的相關(guān)區(qū)域可與動(dòng)力蛋白輕鏈(LC8)直接結(jié)合介導(dǎo)RABV逆軸漿傳輸,但P蛋白上缺失此區(qū)域的重組RABV仍能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)擴(kuò)散。應(yīng)用囊膜和衣殼雙熒光標(biāo)記揭示RABV以完整病毒粒子在胞內(nèi)運(yùn)輸。由于胞內(nèi)體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)幕痉绞?內(nèi)吞入胞物質(zhì)利用不同類型的胞內(nèi)體被分選和定向運(yùn)輸?shù)侥康膮^(qū)域。Rabs是G蛋白超家族成員,是一類定位于不同類型胞內(nèi)體的重要調(diào)控因子,其中Rab5和Rab7分別定位于早期、晚期胞內(nèi)體,參與胞內(nèi)體分選、成熟和定向運(yùn)輸。已有研究表明,多種有囊膜病毒如流感病毒(IV)、水泡性口炎病毒(VSV)以及腺病毒(ADV)等都可利用胞內(nèi)體系統(tǒng)進(jìn)行運(yùn)輸,且在不同程度上受到Rab5與Rab7的調(diào)控。然而,RABV感染神經(jīng)細(xì)胞是否也依賴于胞內(nèi)體系統(tǒng),Rab5、Rab7是否參與調(diào)控RABV感染進(jìn)程尚不清楚。為此,本研究制備了大鼠胚胎皮層原代神經(jīng)元,利用免疫熒光分別標(biāo)記早期胞內(nèi)體標(biāo)志蛋白R(shí)ab5、EEA1和晚期胞內(nèi)體標(biāo)志蛋白R(shí)ab7、LAMP1,初步篩選神經(jīng)細(xì)胞中與RABV共定位的囊泡類型,對(duì)RABV感染的原代神經(jīng)元制作電鏡超薄切片,觀察病毒粒子在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的分布情況,借助免疫膠體金標(biāo)記Rab5與Rab7,進(jìn)一步確定RABV定位的囊泡類型;采用RNAi技術(shù)下調(diào)N2a和SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Rab5與Rab7的表達(dá),通過(guò)免疫熒光、Western blot及TCID50等技術(shù),檢測(cè)RABV在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度、N蛋白表達(dá)水平和病毒滴度等;最后,構(gòu)建RFP-Rab5與RFP-Rab7融合表達(dá)載體,利用電轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入原代神經(jīng)細(xì)胞內(nèi),為RABV與胞內(nèi)體雙熒光活細(xì)胞示蹤奠定基礎(chǔ)。結(jié)果顯示,RABV感染神經(jīng)元后,分別與早期胞內(nèi)體標(biāo)志蛋白R(shí)ab5、EEA1及晚期胞內(nèi)體標(biāo)志蛋白R(shí)ab7、LAMP1出現(xiàn)典型的共定位,神經(jīng)元超薄切片顯示RABV存在于胞漿膜狀細(xì)胞器內(nèi),免疫膠體金標(biāo)記指示RABV所在囊泡膜上有Rab5和Rab7標(biāo)志,印證了RABV感染需要早期和晚期胞內(nèi)體參與。在N2a和SH-SY5Y細(xì)胞中RABV也與Rab5和Rab7發(fā)生了顯著共定位,用si RNA下調(diào)Rab5與Rab7后,RABV感染初期病毒熒光強(qiáng)度、N蛋白表達(dá)量均顯著下降,病毒TCID50也隨之降低,表明RABV感染初期受到Rab5、Rab7的調(diào)控,并且Rab5下調(diào)后RABV主要滯留在細(xì)胞膜附近,Rab7下調(diào)后RABV彌散分布在胞漿內(nèi),提示Rab5主要參與RABV入胞后的分選,Rab7負(fù)責(zé)指導(dǎo)RABV向細(xì)胞核的定向運(yùn)輸,二者共同參與調(diào)控RABV感染;最后,我們構(gòu)建出Rab5、Rab7的紅色熒光蛋白融合表達(dá)質(zhì)粒,利用電轉(zhuǎn)染成功導(dǎo)入原代神經(jīng)元并正常表達(dá),為活細(xì)胞示蹤,從動(dòng)力學(xué)角度研究Rab5、Rab7對(duì)RABV逆軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)本研究,得出以下結(jié)論:1.RABV感染需要早、晚期胞內(nèi)體參與,初步確定了參與RABV感染的胞內(nèi)體類型;2.RABV感染初期受到Rab5與Rab7的調(diào)控,二者對(duì)RABV入胞后的分選和定向運(yùn)輸發(fā)揮作用;3.應(yīng)用電轉(zhuǎn)染將標(biāo)記蛋白發(fā)光質(zhì)粒成功導(dǎo)入神經(jīng)元,為后期活細(xì)胞內(nèi)RABV逆軸漿示蹤的動(dòng)力學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：狂犬病病毒 胞內(nèi)體系統(tǒng) 胞內(nèi)體 神經(jīng)元 Rab5 Rab7
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-11
• 英文縮寫詞表11-12
• 引言12-13
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述13-25
• 第1章 狂犬病病毒致病機(jī)制研究進(jìn)展13-17
• 1. RABV特征及結(jié)構(gòu)蛋白功能13-14
• 2. RABV致神經(jīng)功能異常機(jī)制14-15
• 3. RABV入胞機(jī)制與毒力相關(guān)15-17
• 第2章 神經(jīng)元胞內(nèi)體運(yùn)輸途經(jīng)的研究進(jìn)展17-25
• 1. 胞內(nèi)體運(yùn)輸是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)幕痉绞?/span>17-20
• 2. Rab蛋白家族在胞內(nèi)體運(yùn)輸途徑中的作用20-23
• 3. 軸突運(yùn)輸障礙與神經(jīng)疾病23-25
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容25-55
• 第1章 神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)參與RABV感染的胞內(nèi)體類型篩選25-38
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料25-27
• 2 實(shí)驗(yàn)方法27-32
• 3 結(jié)果32-36
• 4 討論36-37
• 5 小結(jié)37-38
• 第2章 Rab5與Rab7對(duì)RABV早期感染的影響38-48
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料38-40
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法40-42
• 3. 結(jié)果42-46
• 4. 討論46-47
• 5. 小結(jié)47-48
• 第3章 熒光蛋白標(biāo)記Rab5、Rab7重組質(zhì)粒構(gòu)建與神經(jīng)元轉(zhuǎn)染48-55
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料48
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法48-51
• 3. 結(jié)果51-53
• 4. 討論53-54
• 5. 小結(jié)54-55
• 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-64
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介64-65
• 作者簡(jiǎn)介及科研成果65-66
• 致謝66-67

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本文編號(hào)：916806