本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇對小鼠精原干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

  更多相關(guān)文章： 精原干細(xì)胞 白藜蘆醇 凋亡 SIRT1 衰老

【摘要】：精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是位于雄性動物睪丸基底膜上由支持細(xì)胞等體細(xì)胞所構(gòu)成的微環(huán)境中的一類干細(xì)胞。它具有干細(xì)胞的典型特征:自我更新和分化。在維持自身數(shù)量相對穩(wěn)定的同時,通過精子發(fā)生源源不斷地產(chǎn)生大量的精子。精原干細(xì)胞是成年雄性哺乳動物體內(nèi)唯一傳遞遺傳和表觀信息的一類成體干細(xì)胞。隨著年齡的不斷增長,精原干細(xì)胞所處微環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞,結(jié)合其自身在受到氧化應(yīng)激等損傷并不斷積累,精原干細(xì)胞自我更新與分化功能逐漸衰退,睪丸中精原干細(xì)胞池日益枯竭,精子數(shù)量和質(zhì)量也隨之驟減,雄性動物生育力下降。白藜蘆醇是一種多酚類植物抗毒素,可以模擬熱量限制延長酵母、線蟲及果蠅等生物的壽命。在小鼠食物中添加白藜蘆醇時,可以通過激活SIRT1蛋白,有效緩解衰老導(dǎo)致的功能衰退,也可以抵抗高脂飲食對機(jī)體器官的損傷。白藜蘆醇的作用具有組織和劑量特異性。它還可以作為化療藥物通過線粒體、p53或BCL2等途徑誘導(dǎo)肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等癌細(xì)胞的凋亡,抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展和惡化。在嘗試使用白藜蘆醇緩解衰老對精原干細(xì)胞造成的損傷同時,應(yīng)首先確定有效的工作濃度,探究白藜蘆醇對精原干細(xì)胞是否有副作用及相關(guān)機(jī)制,避免二次損傷。白消安是骨髓移植前最常用的清髓藥物,也是癌癥治療過程中化療藥物的一種。作為一種烷化劑,白消安主要通過引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高和DNA-DNA、DNA-蛋白、蛋白-蛋白交聯(lián)等,破壞遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性,誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。與衰老作用機(jī)制相似,白消安在臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)生殖毒性,并依此建立小鼠無精癥模型,為精原干細(xì)胞移植和自我更新、分化以及衰老的研究奠定基礎(chǔ)。本研究首先鑒定體外培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞系C18-4的生物學(xué)特性,再檢測不同濃度白藜蘆醇對其細(xì)胞活力、增殖和凋亡水平的影響,并進(jìn)一步經(jīng)過線粒體膜電位、SIRT1-FOXO1信號通路和DNA完整性等實驗探究各濃度白藜蘆醇的作用機(jī)制,為初步探索白藜蘆醇干預(yù)白消安引起的精原干細(xì)胞損傷實驗提供參照。本試驗為白藜蘆醇對化療或者衰老過程中雄性生育能力保護(hù)的研究奠定基礎(chǔ)。1.白藜蘆醇對小鼠精原干細(xì)胞系C18-4生物學(xué)特性的影響經(jīng)過形態(tài)學(xué)和免疫熒光染色方法觀察C18-4細(xì)胞呈圓形或橢圓形、核質(zhì)比高,表達(dá)PLZF、NANOS2、VASA、SSEA1、CD49f,不表達(dá)STRA8等A型精原干細(xì)胞的典型特征。2μM白藜蘆醇可促進(jìn)C18-4細(xì)胞活力,但隨著濃度升高,C18-4細(xì)胞活力逐漸下降。20μM將C18-4細(xì)胞增殖阻滯在S期,而當(dāng)濃度升至200μM時,C18-4細(xì)胞核皺縮,細(xì)胞空泡化,增殖被抑制,凋亡率顯著升高。2.初步探究不同濃度白藜蘆醇對小鼠精原干細(xì)胞的作用機(jī)理線粒體膜電位檢測表明2μM白藜蘆醇可以保護(hù)線粒體完整性,促進(jìn)能量代謝。而20μM和200μM劑量的白藜蘆醇損傷線粒體功能。在200μM處理后DNA雙鏈發(fā)生斷裂,加劇C18-4細(xì)胞凋亡的發(fā)生。隨著白藜蘆醇濃度的升高,SIRT1蛋白表達(dá)量也逐漸增多,降低FOXO1的乙�；揎椝�,且在小鼠精原干細(xì)胞內(nèi)FOXO1蛋白從核、質(zhì)分布逐漸集中到細(xì)胞核分布。凋亡相關(guān)蛋白p38表達(dá)量與白藜蘆醇濃度正相關(guān),而抗凋亡蛋白BCL2在2μM白藜蘆醇刺激下表達(dá)量升高,200μM時BCL2表達(dá)受抑制,促進(jìn)凋亡的發(fā)生。3.白藜蘆醇促進(jìn)小鼠無精癥模型精原干細(xì)胞的恢復(fù)白消安腹腔注射4周后,小鼠睪丸中曲細(xì)精管精原干細(xì)胞位置呈空泡化,附睪中精子完全消失。當(dāng)進(jìn)行白藜蘆醇干預(yù)時,可以促進(jìn)精原干細(xì)胞的恢復(fù),其中100 mg/kg/d劑量的白藜蘆醇作用最明顯,此時附睪中可以觀察到精子存在。實時熒光定量PCR檢測表明,白藜蘆醇可以抑制凋亡相關(guān)基因p53、c-Myc和FoxO1的轉(zhuǎn)錄,而精原干細(xì)胞的標(biāo)記基因Thy1、Plzf表達(dá)量相對升高,分化標(biāo)記基因c-Kit和支持細(xì)胞標(biāo)記基因Sox9表達(dá)量相對下降,增殖標(biāo)記基因Pcna表達(dá)量上調(diào)。說明白藜蘆醇可以通過抑制精原干細(xì)胞凋亡,促進(jìn)增殖,從而增強(qiáng)其在白消安受損后的恢復(fù)能力。Western-Blotting檢測顯示白藜蘆醇干預(yù)后SIRT1蛋白顯著性上調(diào),并去乙�；掠蜦OXO1蛋白。
【關(guān)鍵詞】：精原干細(xì)胞 白藜蘆醇 凋亡 SIRT1 衰老
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S859.7
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-26
• 1.1 精原干細(xì)胞研究進(jìn)展14-18
• 1.1.1 精原干細(xì)胞的定義與生物學(xué)特性15-16
• 1.1.2 精原干細(xì)胞自我更新機(jī)制的研究16-17
• 1.1.3 精原干細(xì)胞衰老的研究17-18
• 1.2 白藜蘆醇的研究進(jìn)展18-24
• 1.2.1 白藜蘆醇的來源與理化性質(zhì)19-20
• 1.2.2 白藜蘆醇與衰老20-24
• 1.3 小結(jié)與展望24-26
• 第二章 不同濃度白藜蘆醇對小鼠精原干細(xì)胞活力的影響26-38
• 2. 引言26
• 2.1 材料26-27
• 2.1.1 實驗材料26
• 2.1.2 主要試劑26-27
• 2.1.3 主要儀器與耗材27
• 2.2 方法27-32
• 2.2.1 主要溶液的配制27-29
• 2.2.2 C18-4 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)與凍存29-30
• 2.2.3 貼壁細(xì)胞免疫熒光染色30
• 2.2.4 CCK-8 檢測細(xì)胞活力30
• 2.2.5 Giemsa染色30
• 2.2.6 細(xì)胞凋亡率的測定30-31
• 2.2.7 BrdU染色31
• 2.2.8 細(xì)胞周期的測定31-32
• 2.3 結(jié)果32-36
• 2.3.1 C18-4 細(xì)胞的生物學(xué)特性32-33
• 2.3.2 不同濃度白藜蘆醇對C18-4 細(xì)胞活力的影響33-34
• 2.3.4 不同濃度白藜蘆醇對C18-4 凋亡水平的影響34-35
• 2.3.5 不同濃度白藜蘆醇對C18-4 增殖周期的影響35-36
• 2.4 討論36
• 2.5 小結(jié)36-38
• 第三章 不同濃度白藜蘆醇對小鼠精原干細(xì)胞作用機(jī)理的研究38-47
• 3.1 材料38-39
• 3.1.1 實驗材料38
• 3.1.2 主要試劑38-39
• 3.1.3 主要儀器與耗材39
• 3.2 方法39-40
• 3.2.1 線粒體膜電位檢測39
• 3.2.2 Western-Blotting39-40
• 3.2.3 貼壁細(xì)胞免疫熒光染色40
• 3.3 結(jié)果40-45
• 3.3.1 白藜蘆醇對小鼠精原干細(xì)胞線粒體膜電位的影響40-42
• 3.3.2 白藜蘆醇影響小鼠精原干細(xì)胞內(nèi)SIRT1蛋白的表達(dá)和定位42-43
• 3.3.3 白藜蘆醇影響小鼠精原干細(xì)胞內(nèi)FOXO1蛋白的表達(dá)和定位43-44
• 3.3.4 高濃度白藜蘆醇引起小鼠精原干細(xì)胞DNA雙鏈斷裂44-45
• 3.3.5 不同濃度白藜蘆醇處理后相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化45
• 3.4 討論45-46
• 3.5 小結(jié)46-47
• 第四章 白藜蘆醇促進(jìn)無精癥模型小鼠精原干細(xì)胞的恢復(fù)47-54
• 4.1 材料47
• 4.1.1 實驗材料47
• 4.1.2 主要試劑47
• 4.1.3 主要儀器與耗材47
• 4.2 方法47-49
• 4.2.1 主要溶液的配制47-48
• 4.2.2 白消安誘導(dǎo)無精癥小鼠模型的構(gòu)建48
• 4.2.3 白藜蘆醇干預(yù)48
• 4.2.4 H&E染色48
• 4.2.5 熒光實時定量PCR48-49
• 4.2.6 Western-Blotting檢測49
• 4.3 結(jié)果49-52
• 4.3.1 白藜蘆醇可以促進(jìn)白消安損傷后精原干細(xì)胞的恢復(fù)49-50
• 4.3.2 白藜蘆醇對無精癥小鼠中相關(guān)基因表達(dá)的影響50-52
• 4.3.3 白藜蘆醇可以通過激活SIRT1促進(jìn)精原干細(xì)胞的恢復(fù)52
• 4.4 討論52-53
• 4.5 小結(jié)53-54
• 結(jié)論54
• 本文研究的創(chuàng)新點(diǎn)及進(jìn)一步研究的課題54-55
• 參考文獻(xiàn)55-68
• 致謝68-70
• 作者簡介70

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1 張仕強(qiáng);畢聰明;彭樹英;呂寧;張涌;;不同培養(yǎng)條件對牛精原干細(xì)胞增殖的影響與特性鑒定[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;2007年06期

2 張學(xué)明,李蓮軍,李德雪,賴良學(xué),潘耀謙;哺乳動物精原干細(xì)胞研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2002年01期

3 張學(xué)明,李晶,李蓮軍,羅秉坤,李德雪;哺乳類精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)影響因素[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2002年05期

4 李蓮軍,盧克煥;哺乳動物精原干細(xì)胞及其生物學(xué)特性[J];廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué);2004年04期

5 張學(xué)明,李德雪,岳占碰;精原干細(xì)胞的體外增殖與分化(英文)[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2005年05期

6 成鋼,馮書堂,牟玉蓮,岳文斌;哺乳動物精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2005年10期

7 孫淼;朱寶長;;精原干細(xì)胞的生命歷程[J];生物技術(shù)通報;2005年06期

8 李蓮軍,盧晟盛,黎宗強(qiáng),楊小淦,盧克煥;精原干細(xì)胞更新分化的影響因素[J];云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2005年01期

9 畢聰明;張仕強(qiáng);彭樹英;李吉霞;張涌;;牛精原干細(xì)胞的分離和純化及體外培養(yǎng)的一般特性[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;2006年10期

10 孫思宇;魏彩霞;李碧春;;精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)及影響因素[J];中國畜牧雜志;2007年05期

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1 吳俠;吳應(yīng)積;羅奮華;于海泉;旭日干;;大鼠精原干細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)的研究[A];第十屆全國生殖生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2005年

2 徐富翠;胡紅梅;吳紹華;;精原干細(xì)胞在成骨培養(yǎng)條件下生物學(xué)特征的研究[A];2007年中國解剖學(xué)會第十屆全國組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2007年

3 余榮嬌;徐斯凡;曾辛;楊俊玲;;表皮生長因子在精原干細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制研究[A];中國生理學(xué)會2004年消化內(nèi)分泌生殖學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2004年

4 畢聰明;張仕強(qiáng);彭樹英;呂寧;張涌;;牛精原干細(xì)胞體外長時間存活增殖及鑒定[A];全國獸醫(yī)外科學(xué)第13次學(xué)術(shù)研討會、小動物醫(yī)學(xué)第1次學(xué)術(shù)研討會暨奶牛疾病第3次學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2006年

5 采克俊;丁海雷;丁志麗;張易祥;張念慈;劉莉;;雞精原干細(xì)胞分離與體外培養(yǎng)的初步研究[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會第九次會員代表大會暨青年學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2007年

6 陳云波;張易祥;張念慈;采克俊;劉莉;;白消安去除公雞精原干細(xì)胞的研究[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會第九次會員代表大會暨青年學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2007年

7 張茨;劉春霞;王玲瓏;楊嗣星;胡云飛;;采用流式細(xì)胞術(shù)分離精原干細(xì)胞的實驗研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國男科學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2007年

8 陶科;涂炯炯;范立青;朱文兵;孫源;盧光t;;鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立及與人精原干細(xì)胞培養(yǎng)體系的比較[A];第一屆中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會、中國動物學(xué)會生殖生物學(xué)分會聯(lián)合年會論文匯編[C];2007年

9 唐立新;范雙喜;文任乾;江芳;徐姍姍;鄧順美;馬春杰;唐運(yùn)革;;大鼠精原干細(xì)胞的分離純化[A];第一屆中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會、中國動物學(xué)會生殖生物學(xué)分會聯(lián)合年會論文匯編[C];2007年

10 胡建新;何堅;;精原干細(xì)胞體外技術(shù)的進(jìn)展[A];2007年貴州省醫(yī)學(xué)會泌尿外科分會學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2007年

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1 記者 李晶晶;海南成功培育猴類精原干細(xì)胞[N];�？谕韴�;2013年

2 高原;吸煙可破壞精原干細(xì)胞[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2007年

3 ;美成功用鼠精原干細(xì)胞培育出幼鼠[N];中國中醫(yī)藥報;2004年

4 劉海英;美科學(xué)家發(fā)現(xiàn)精原干細(xì)胞有望替代醫(yī)用胚胎干細(xì)胞[N];科技日報;2009年

5 高原;吸煙損害精子質(zhì)量[N];人民日報;2007年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 薩初拉;牛精原干細(xì)胞分離純化及長期培養(yǎng)研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2013年

2 王菊花;山羊精原干細(xì)胞體外增殖及其分化的調(diào)控[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 阿拉達(dá)爾;山羊精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立與移植研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

4 羅小敏;小鼠精原干細(xì)胞體內(nèi)增殖和分化階段睪丸組織基因的差異表達(dá)[D];武漢大學(xué);2010年

5 張巖;大鼠精原干細(xì)胞的長期培養(yǎng)、鑒定及其特異標(biāo)記基因表達(dá)載體的構(gòu)建[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2011年

6 劉陶迪;大鼠青春期前期精原干細(xì)胞自我更新和分化相關(guān)基因表達(dá)的初步研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2012年

7 張學(xué)明;小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)體系的優(yōu)化及體外基因轉(zhuǎn)移[D];吉林大學(xué);2005年

8 李恩中;精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及自增殖相關(guān)因子的篩選與初步研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

9 張世慶;精原干細(xì)胞自增殖分子機(jī)制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

10 烏云畢力格;綿羊精原干細(xì)胞的分離富集與體外培養(yǎng)研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2011年

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1 凡志國;小鼠精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)與冷凍技術(shù)研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

2 穆海龍;PLZF通過靶向抑制miR-146a促進(jìn)CXCR4表達(dá)調(diào)控奶山羊精原干細(xì)胞增殖[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

3 田稼;精原干細(xì)胞動態(tài)標(biāo)記物的初步篩選[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

4 蔡桓;牛精原干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和組蛋白H3K9三甲基化修飾研究[D];吉林大學(xué);2016年

5 吳崇洋;白藜蘆醇對小鼠精原干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

6 牛博文;褪黑素通過刺激支持細(xì)胞分泌GDNF促進(jìn)奶山羊精原干細(xì)胞的增殖[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

7 王麗莉;基因轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞在受體微環(huán)境中的增殖與分化[D];首都師范大學(xué);2008年

8 丁曉麟;小鼠精原干細(xì)胞分離、純化、冷凍、培養(yǎng)、移植及其體內(nèi)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 邢柳;小鼠精原干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)與移植的初步研究[D];中南大學(xué);2010年

10 宋銳;小鼠精原干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

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本文編號：911165