本文關(guān)鍵詞：山羊溶酶體α-甘露糖苷酶D221位點的截短表達及其特性研究

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【摘要】：瘋草是我國西部草場主要有毒植物且嚴(yán)重危害草地畜牧業(yè),瘋草中毒主要原因是其毒性成分苦馬豆素(swainsonine,SW)能夠抑制細(xì)胞中溶酶體α-甘露糖苷酶(lysosomal AMA,LAM)的活性,細(xì)胞內(nèi)寡聚糖積聚,使細(xì)胞空泡化,甚至動物死亡。山羊溶酶體a-甘露糖苷酶(Capra hircas LAM,chLAM)的研究將有助于探明動物瘋草中毒的機理,為防治動物瘋草中毒提供資料。目前的研究表明,chLAM的活性中心由9個保守的氨基酸位點構(gòu)成。依據(jù)chLAM的活性中心活性位點的氨基酸保守性程度不同,對基因chLAM進行包括和不包括D221位點的截短,chLAM-D222、chLAM-D220截短片段,以研究截短至D221位點對chLAM表達量及酶活性質(zhì)的影響。結(jié)果如下:1.以chLAM基因序列為模板,設(shè)計chLAM、chLAM-D222、chLAM-D220特異性引物,獲得正確目的基因片段;2.成功構(gòu)建了酵母表達重組質(zhì)粒pPIC9K-chLAM,pPIC9K-chLAM-D222和pPIC9K-chLAM-D220,線性化后電轉(zhuǎn)入表達菌株GS115,甲醇終濃度0.6%誘導(dǎo)表達;重組蛋白進行酶活測定,分別為54.7 U、93.8 U、173.6 U,表達量為12.7μg/mg、32.4μg/mg、34.8μg/mg;3.重組蛋白純化后,SDS-PAGE顯示在約108 kDa(chLAM)、84 kDa(chLAM-D222、chLAM-D220)處有單一目的蛋白條帶;4.純化重組蛋白的WB檢測,PVDF膜上可見108 kDa(chLAM)、84 kDa(chLAM-D222、chLAM-D220)處有單一抗原條帶;5.重組蛋白chLAM、chLAM-D222、chLAM-D220的最適溫度分別為55℃、35℃、35℃,最適pH分別為4.5、3.5、4.0;Zn~（2+）、Ca~（2+）對3種酶均有促進作用,Cu~（2+）、Co~（2+）對3種酶均有抑制作用;均對SW敏感,截短蛋白的活性不易被SW抑制。依據(jù)試驗結(jié)果可知,通過對包括和不包括D221位點的截短提高了chLAM在畢赤酵母中的酶活及表達量,為酶活性中心位點的選擇提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：溶酶體α-甘露糖苷酶 截短表達 畢赤酵母 特性研究
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.2
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 第一章 溶酶體 α-甘露糖苷酶及截短基因外源表達的研究進展9-17
• 1.1 不同物種 α-甘露糖苷酶的研究9-12
• 1.1.1 人溶酶體 α-甘露糖苷酶9-10
• 1.1.2 牛溶酶體 α-甘露糖苷酶10
• 1.1.3 羊溶酶體 α-甘露糖苷酶10-11
• 1.1.4 果蠅溶酶體 α-甘露糖苷酶11
• 1.1.5 釀膿鏈球菌 α-甘露糖苷酶11
• 1.1.6 α-甘露糖苷酶同源性比對11-12
• 1.2 截短基因外源表達的研究12-17
• 1.2.1 截短基因外源表達的意義12-15
• 1.2.2 截短位點的選擇15-17
• 第二章 山羊溶酶體 α-甘露糖苷酶截短基因的克隆及鑒定17-21
• 2.1 材料17
• 2.1.1 主要儀器17
• 2.1.2 主要試劑17
• 2.1.3 培養(yǎng)基17
• 2.2 方法17-18
• 2.2.1 截短蛋白chLAM-D220的生物信息學(xué)分析17
• 2.2.2 截短基因的克隆及鑒定17-18
• 2.3 結(jié)果18-19
• 2.3.1 截短蛋白chLAM-D220的生物信息學(xué)分析18-19
• 2.3.2 截短基因的克隆及鑒定19
• 2.4 討論19-20
• 2.4.1 截短蛋白生物信息學(xué)分析19-20
• 2.4.2 基因chLAM截短位點的選擇20
• 2.5 小結(jié)20-21
• 第三章 chLAM截短蛋白的表達、純化及其特性研究21-31
• 3.1 材料21-22
• 3.1.1 主要儀器21
• 3.1.2 主要試劑21
• 3.1.3 培養(yǎng)基21-22
• 3.2 方法22-25
• 3.2.1 克隆質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定22
• 3.2.2 表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定22
• 3.2.3 表達菌株GS115的構(gòu)建與鑒定22-23
• 3.2.4 表達菌株GS115的篩選和鑒定23
• 3.2.5 表達菌株GS115的誘導(dǎo)表達23
• 3.2.6 酵母表達產(chǎn)物酶活性的測定23-24
• 3.2.7 重組蛋白的純化及酶特性研究24-25
• 3.3 結(jié)果25-28
• 3.3.1 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定25
• 3.3.2 重組酵母菌株基因組的PCR鑒定25
• 3.3.3 重組蛋白酶活性的測定25-26
• 3.3.4 重組蛋白的純化26
• 3.3.5 重組蛋白的酶特性研究26-28
• 3.4 討論28-30
• 3.4.1 截短對酶活及表達量的影響28-29
• 3.4.2 截短表達對酶反應(yīng)溫度、pH及金屬離子的影響29
• 3.4.3 截短表達對SW抑制chLAM的影響29-30
• 3.5 小結(jié)30-31
• 結(jié)論31-32
• 參考文獻32-38
• 致謝38-39
• 作者簡介39

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本文編號：903818