本文關(guān)鍵詞：豬腸黏膜保護因子的短小芽孢桿菌表達系統(tǒng)建立

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【摘要】：仔豬腹瀉的發(fā)生主要由腸黏膜屏障功能受損引起�？狗置谝蜃�(Antisecretory factor,AF)、血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase,HO-1)、腸三葉肽因子(Trefoil factor family 3,TFF3)能修復上皮細胞損傷,在腸黏膜屏障功能維持中發(fā)揮重要作用。短小芽孢桿菌表達系統(tǒng)能高效分泌表達外源蛋白,且不產(chǎn)生內(nèi)毒素,能調(diào)節(jié)腸道的微生態(tài)平衡。自然分離腸黏膜保護因子的成本高、產(chǎn)量和活性較低,很難直接用于工業(yè)化生產(chǎn)或作為飼料添加劑使用。本文旨在建立豬腸黏膜保護因子(AF、HO-1、TFF3)的短小芽孢桿菌表達系統(tǒng),為降低仔豬腹瀉發(fā)生、保護腸黏膜屏障提供新思路和新方法。利用PCR方法從豬組織中克隆AF、HO-1、TFF3基因,以pNCMO2為載體分別構(gòu)建重組表達載體pNCMO2-TFF3、pNCMO2-HO-1、pNCMO2-AF,利用電轉(zhuǎn)的方法將重組表達載體pNCMO2-TFF3、pNCMO2-HO-1、pNCMO2-AF轉(zhuǎn)入短小芽孢桿菌,SDS-PAGE和Western Blot方法分析AF、HO-1、TFF3基因在短小芽孢桿菌中的融合表達。結(jié)果表明,克隆了豬AF、HO-1、TFF3基因,全長分別為1164bp、897bp、273bp,分別編碼387個、298個和87個氨基酸;電泳和測序表明與預期目的基因片段大小一致;成功構(gòu)建了豬重組表達載體pNCMO2-TFF3、pNCMO2-HO-1、pNCMO2-AF,菌液PCR和雙酶切結(jié)果鑒定正確;電轉(zhuǎn)后的酶切鑒定結(jié)果顯示,分別在5200bp處獲得pNCMO2載體片段和1164bp、897bp、273bp的目的基因AF、HO-1、TFF3片段;蛋白表達分析SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果顯示,誘導表達蛋白AF、HO-1、TFF3大小分別為46.3KD、36.5KD和13.6KD,與預期大小一致,且為胞外分泌。綜上結(jié)果提示,成功構(gòu)建了豬腸黏膜保護因子的芽孢桿菌表達系統(tǒng),為仔豬腹瀉的防治提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：腸黏膜保護因子 pNCMO2載體 短小芽孢桿菌 SDS-PAGE Western Blot 誘導表達
【學位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 致謝4-5
• 英文縮略詞表5-9
• 摘要9-10
• 1 文獻綜述10-18
• 1.1 仔豬腹瀉10
• 1.2 腸黏膜保護因子10-14
• 1.2.1 抗分泌因子（AF）10-11
• 1.2.1.1 抗分泌因子（AF）結(jié)構(gòu)特點和性質(zhì)10-11
• 1.2.1.2 抗分泌因子（AF）生理功能11
• 1.2.2 血紅素加氧酶（HO）11-13
• 1.2.2.1 血紅素加氧酶（HO）結(jié)構(gòu)特點和性質(zhì)11-12
• 1.2.2.2 血紅素加氧酶-1（HO-1）生理功能12-13
• 1.2.3 三葉肽13-14
• 1.2.3.1 三葉肽結(jié)構(gòu)特點和性質(zhì)13-14
• 1.2.3.2 腸三葉因子(TFF3)生理功能14
• 1.3 短小芽孢桿菌及其表達系統(tǒng)14-17
• 1.3.1 短小芽孢桿菌15-16
• 1.3.1.1 短小芽孢桿菌作為基因工程菌優(yōu)勢15
• 1.3.1.2 短小芽孢桿菌作為益生菌的優(yōu)勢15-16
• 1.3.2 表達載體pNCMO216-17
• 1.4 展望17-18
• 2 引言18-19
• 3 材料與方法19-29
• 3.1 試驗材料19
• 3.2 菌株和質(zhì)粒19
• 3.3 主要試劑19
• 3.4 主要儀器19
• 3.5 常規(guī)試劑配制19-22
• 3.5.1 核酸電泳試劑19
• 3.5.2 SDS-PAGE試劑19-20
• 3.5.3 Western Blot試劑20-21
• 3.5.4 培養(yǎng)基配制21
• 3.5.5 抗生素配制21-22
• 3.5.6 其他試劑配制22
• 3.6 豬腸黏膜保護因子的克隆22-24
• 3.6.1 豬AF、HO-1、TFF3基因引物設(shè)計22-23
• 3.6.2 RNA提取23
• 3.6.3 cDNA合成23
• 3.6.4 豬AF、HO-1、TFF3基因PCR擴增23-24
• 3.6.5 PCR產(chǎn)物膠回收24
• 3.7 重組表達載體構(gòu)建24-26
• 3.7.1 豬腸黏膜保護因子連接pMD19-T載體24
• 3.7.2 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞24
• 3.7.3 陽性克隆菌的篩選與鑒定24-25
• 3.7.4 載體雙酶切25
• 3.7.5 酶切產(chǎn)物膠回收25
• 3.7.6 T4 DNA連接酶連接反應(yīng)25-26
• 3.7.7 陽性克隆菌的篩選與鑒定26
• 3.8 豬腸黏膜保護因子在短小芽孢桿菌中的誘導表達26-29
• 3.8.1 短小芽孢桿菌的電轉(zhuǎn)化26-27
• 3.8.1.1 短小芽孢桿菌的培養(yǎng)26
• 3.8.1.2 短小芽孢桿菌感受態(tài)的制備26
• 3.8.1.3 電穿孔轉(zhuǎn)化26-27
• 3.8.1.4 陽性克隆菌的篩選與鑒定27
• 3.8.2 豬AF、HO-1、TFF3基因的誘導表達27
• 3.8.3 樣品處理27
• 3.8.4 SDS-PAGE27
• 3.8.5 Western Blot27-29
• 4 結(jié)果與分析29-39
• 4.1 豬腸黏膜保護因子的克隆及鑒定29-30
• 4.2 重組表達載體的構(gòu)建30-33
• 4.2.1 pMD19-T-AF、pMD19-T-HO-1、pMD19-T-TFF3載體構(gòu)建30-31
• 4.2.2 pNCMO2-AF、pNCMO2-HO-1、pNCMO2-TFF3載體構(gòu)建31-33
• 4.3 豬腸黏膜保護因子在短小芽孢桿菌中的誘導表達33-39
• 4.3.1 短小芽孢桿菌的培養(yǎng)33
• 4.3.2 短小芽孢桿菌的電轉(zhuǎn)化33-36
• 4.3.3 SDS-PAGE檢測豬腸黏膜保護因子的表達36-37
• 4.3.4 Western blot檢測豬腸黏膜保護因子的表達37-39
• 5 結(jié)論與討論39-41
• 5.1 討論39-40
• 5.1.1 豬腸黏膜保護因子基因克隆39
• 5.1.2 豬腸黏膜保護因子短小芽孢桿菌表達系統(tǒng)39-40
• 5.2 結(jié)論40-41
• 參考文獻41-52
• ABSTRACT52

【參考文獻】

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本文編號：898660