本文關(guān)鍵詞：H9N2亞型禽流感病毒的序列分析及其生物學(xué)特性研究

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【摘要】：禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起的一種禽類的病毒性傳染病。H9N2亞型禽流感病毒是最常見的低致病性禽流感病毒,最早于1966年從北美的火雞體內(nèi)分離得到,此后相繼在世界其他地方被發(fā)現(xiàn),并呈廣泛流行的態(tài)勢(shì),危害持久不易控制,給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。值得注意的是,H9N2亞型禽流感病毒在家禽中偶爾會(huì)傳播到哺乳動(dòng)物中,包括人類和豬,也是97年香港禽流感感染人的H5N1禽流感病毒的內(nèi)部基因的供體。因此,具有潛在導(dǎo)致新型流感的大流行。本試驗(yàn)從2011年起至2014年在本校附屬動(dòng)物醫(yī)院以及活禽市場(chǎng)定期采集病料,對(duì)所采集的病料進(jìn)行分離鑒定,并從每年所鑒定出的H9N2亞型禽流感病毒中各選取2株H9N2亞型禽流感病毒毒株,研究不同年間H9N2亞型禽流感病毒株之間抗原差異性以及生物學(xué)特性。1.H9N2亞型禽流感病毒的分離鑒定本試驗(yàn)在揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院以及江蘇省揚(yáng)州市活禽市場(chǎng)定期采集病料,對(duì)所采集的病料進(jìn)行分離鑒定,對(duì)鑒定的H9亞型病毒,按照分離的年代,選擇每年2株病毒制作雞源高免血清和EIDso檢測(cè),測(cè)定分離株之間的交叉HI效價(jià),分析分離株之間的抗原性關(guān)系。分離株與Ck/GD/SS/94和Ck/SH/F/98株多抗血清的H1檢測(cè)結(jié)果顯示,2011年至2014年的分離株大多與Ck/GD/SS/94和Ck/SH/F/98株的多抗血清的有較好的反應(yīng),表明大部分分離株的抗原性與Ck/GD/SS/94或Ck/SH/F/98的抗原性差異性不大；而分離株Ck/HB/11、 Ck/JS/TM58/13和Ck/JS/JT95/13與Ck/GD/SS/94株的多抗血清的HI效價(jià)小于8：分離株Ck/SD/C9QH/11株與Ck/SH/F/98株的多抗血清的HI效價(jià)小于8：表明Ck/HB/11、 Ck/JS/TM58/13和Ck/JS/JT95/13與Ck/GD/SS/94株、Ck/SD/C9QH/11與Ck/SH/F/98株的抗原性有顯著差異；此外,交叉血凝抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),大部分分離株與Ck/SD/C9QH/11和Ck/JS/JT95/13的血清不反應(yīng),而與2013-2014年分離株的多抗血清有較好的HI效價(jià),表明近幾年分離株的血清能夠抑制早期的分離株,分離株的抗原性隨著時(shí)間推移發(fā)生了變異。從病毒在MDCK細(xì)胞的TCID50的結(jié)果來看,大部分分離株與Ck/SH/F/98毒株的TCID50相似,而Ck/JS/ZJ618/12、Ck/YZ640/12和Ck/AH/WB/14毒株感染細(xì)胞的能力較弱,其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。2.分離株HA基因及部分分離株全基因序列分析為進(jìn)一步研究H9N2亞型禽流感病毒的遺傳進(jìn)化規(guī)律,本試驗(yàn)對(duì)分離的29株H9亞型禽流感病毒的HA基因進(jìn)行測(cè)序和分析,同時(shí)選擇其中的8株病毒進(jìn)行全基因序列的測(cè)定測(cè)序。序列分析結(jié)果顯示,29株分離株的HA基因都屬于Ck/JS/1/00-like分支亞系,即Beijing/94-like分支；但又與Beijing/94-like存在一定的差異性,同時(shí)也能看出大部分浙江、山東、江蘇來源的分離株都屬于同一分支。分離株血凝素裂解位點(diǎn)335-338位的氨基酸序列大部分是R-S-S-R, Ck/JS/YZ150/12、Ck/JS/YZ667/12、Ck/HLJ/DD/11、Ck/HB/11 Ck/JS/JT12/11株的氨基酸序列為K-S-S-R,即為典型的低致病性禽流感病毒特征性序列；29株分離株大部分在HA蛋白含有8個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)；與Ck/SH/F/98株的HA基因比較,近幾年分離株在220位發(fā)生氨基酸了T→1或者T→V的變化：分離株HA基因的受體結(jié)合位點(diǎn)的7個(gè)關(guān)鍵性氨基酸殘基中的190位氨基酸殘基的變異頻繁。本試驗(yàn)中所有分離株的234位氨基酸殘基都是與Neu5Aca2-6Gal的受體結(jié)合特性有關(guān)的Leu。8個(gè)代表株中有7株的NA基因基本來自Beijing/94-like分支,并且NA基因氨基酸位點(diǎn)大部分高度保守,僅近年的分離株NA基因多了2個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)。分離株的NP、NS、PB1基因?qū)儆贑k/SH/F/98-like亞系。M基因?qū)儆赒a/HK/G1/97-like亞系。PB2與PA基因?qū)儆贕9/97-like亞系。Ck/JS/TM58/13、Ck/JS/JT95/13、Ck/JS/TM71/14株的NP基因與Ck/JS/SC537/13(H7N9)株的同源性非常高,表明目前雞源H9N2亞型禽流感病毒是G9-like、F/98-like和G1-like的重組體,并且是H7N9禽流感病毒內(nèi)部基因的供體。3.分離株致病特性及其傳播特性研究本實(shí)驗(yàn)擬將選擇的8株H9N2亞型禽流感病毒毒株(Ck/SD/C9QH/11、Ck/JS/JT12/11、 Ck/JS/ZJ618/12、Ck/JS/YZ640/12、Ck/JS/TM58/13、Ck/JS/JT95/13、Ck/AH/WB/14 Ck/JS/TM71/14)和經(jīng)典毒株Ck/SH/F/98進(jìn)行致病性和傳播特性研究。將120只3周齡的SPF雞分為10大組,每組12只；其中一組為空白對(duì)照組,不接種任何病毒；其余9大組分別進(jìn)行一株H9N2亞型禽流感病毒的致病性和傳播特性的研究；每組中6只雞,接種病毒作為攻毒組,3只雞與攻毒雞同籠飼養(yǎng)作為直接接觸組,3只雞置于距離攻毒雞50 cm處的另一籠子飼養(yǎng)作為氣溶膠傳播組,不接種病毒；在攻毒組攻毒后第3、5天,對(duì)攻毒組、直接接觸組和氣溶膠傳播組分別采集實(shí)驗(yàn)雞的氣管和泄殖腔棉拭子以分離病毒,同時(shí)對(duì)攻毒組雞每次撲殺3只攻毒,取其氣管和肺進(jìn)行組織病理學(xué)的觀察；結(jié)果發(fā)現(xiàn),所選擇的代表株對(duì)雞都有氣溶膠傳播的特性；分離株在雞氣管中的復(fù)制能力都強(qiáng)于在肺組織中的復(fù)制能力,其中Ck/JS/ZJ618/12株比其余毒株在肺組織中的復(fù)制能力強(qiáng)；顯微病理變化結(jié)果顯示,2013年和2014年分離株感染雞第5d比第3d的氣管病理變化嚴(yán)重,而2011-2012年分離株感染雞第5d比第3d的肺組織病理變化嚴(yán)重。結(jié)果表明,2011-2014年分離株對(duì)雞都具有氣溶膠傳播特性；近3年分離株在氣管中的復(fù)制和致病能力都強(qiáng)于在肺組織中的復(fù)制和致病能力,其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：H9N2亞型禽流感病毒 分離鑒定 抗原變異 傳播特性 致病性
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-12
• 符號(hào)說明12-13
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述13-25
• 1 我國(guó)H9N2亞型禽流感病毒的歷史和流行病學(xué)13-15
• 2 H9N2亞型禽流感病毒在雞的臨床癥狀15
• 3 我國(guó)H9N2亞型禽流感病毒抗原漂移15-16
• 4 我國(guó)H9N2亞型禽流感病毒種間傳播16-18
• 5 我國(guó)H9N2亞型禽流感病毒的遺傳和生物進(jìn)化18-19
• 6 H9N2亞型禽流感病毒在動(dòng)物模型的毒力,傳遞和分子機(jī)制19-20
• 7 H9N2基因供體的新型流感病毒20-21
• 參考文獻(xiàn)21-25
• 第二部分 論文試驗(yàn)25-73
• 第一章 H9N2亞型禽流感病毒的分離鑒定25-37
• 1 材料25-27
• 1.1 病料來源以及病毒25
• 1.2 SPF雞胚、試驗(yàn)動(dòng)物25
• 1.3 試劑25-26
• 1.4 試劑配制26
• 1.5 主要儀器設(shè)備26-27
• 2 方法27-29
• 2.1 流行病學(xué)調(diào)查27
• 2.2 病毒的分離與鑒定27
• 2.2.1 病料處理27
• 2.2.2 雞胚接種27
• 2.2.3 血凝、血凝抑制試驗(yàn)27
• 2.3 純化并擴(kuò)增病毒27
• 2.4 H9N2亞型禽流感病毒油乳劑疫苗制備27-28
• 2.5 H9N2亞型血清制備28
• 2.6 HI交叉試驗(yàn)28
• 2.7 病毒雞胚半數(shù)感染量(EID_(50))和雞胚半數(shù)致死量(ELD_(50))測(cè)定28-29
• 2.8 半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量(TCID_(50))測(cè)定29
• 2.8.1 MDCK細(xì)胞的制備29
• 2.8.2 病毒的稀釋29
• 2.8.3 接種病毒29
• 3 結(jié)果29-35
• 3.1 病毒分離與鑒定29-30
• 3.2 HI交叉試驗(yàn)30-34
• 3.3 分離株EID_(50)、ELD_(50)和TCID_(50)的測(cè)定34-35
• 4 討論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-37
• 第二章 分離株HA基因及部分分離株全基因測(cè)序分析37-56
• 1 材料37-38
• 1.1 病毒37
• 1.2 SPF雞胚37
• 1.3 試劑37
• 1.4 試劑配制37-38
• 1.5 主要儀器設(shè)備38
• 2 方法38-41
• 2.1 純化并擴(kuò)增病毒38
• 2.2 擴(kuò)增病毒HA基因片段并測(cè)序38-39
• 2.2.1 反轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計(jì)38
• 2.2.2 HA基因RT-PCR引物設(shè)計(jì)38-39
• 2.2.3 病毒RNA提抽39
• 2.2.4 HA基因的擴(kuò)增39
• 2.2.5 1%瓊脂糖凝膠電泳39
• 2.3 擴(kuò)增病毒全基因片段并測(cè)序39-41
• 2.3.1 反轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計(jì)39
• 2.3.2 全基因RT-PCR引物設(shè)計(jì)39-40
• 2.3.3 病毒RNA提抽40
• 2.3.4 全基因的擴(kuò)增40-41
• 2.3.5 1%瓊脂糖凝膠電泳41
• 2.4 序列分析41
• 3 結(jié)果41-55
• 3.1 分離株HA基因擴(kuò)增和測(cè)序41-46
• 3.1.1 RT-PCR擴(kuò)增41-42
• 3.1.2 分離株HA基因遺傳進(jìn)化分析42-43
• 3.1.3 分離株HA基因核苷酸同源性分析43
• 3.1.4 分離株HA氨基酸變異分析43-46
• 3.2 8株分離株區(qū)域7個(gè)基因序列比較46-55
• 3.2.1 RT-PCR擴(kuò)增46-47
• 3.2.2 PB2基因分析47
• 3.2.3 PB1基因分析47-48
• 3.2.4 PA基因分析48-49
• 3.2.5 NP基因分析49-50
• 3.2.6 NA基因50-53
• 3.2.7 M基因分析53
• 3.2.8 NS基因分析53-55
• 4 討論55
• 參考文獻(xiàn)55-56
• 第三章 分離株致病性及其傳播特性研究56-73
• 1 材料56-57
• 1.1 病毒56
• 1.2 SPF雞胚、試驗(yàn)動(dòng)物56
• 1.3 試劑56-57
• 1.4 試劑配制57
• 1.5 主要儀器設(shè)備57
• 2 方法57-59
• 2.1 病毒的純化與擴(kuò)增57
• 2.2 病毒對(duì)雞致病性試驗(yàn)57-59
• 2.2.1 動(dòng)物試驗(yàn)分組57-58
• 2.2.2 病毒處理、接種與檢測(cè)58-59
• 2.2.3 石蠟切片的制作59
• 3 結(jié)果59-70
• 3.1 分離株的復(fù)制與傳播59-61
• 3.1.1 分離株感染雞后氣管和泄殖腔棉拭子病毒分離59-60
• 3.1.2 分離株感染雞后氣管和肺組織內(nèi)病毒EID_(50)和ELD_(50)60-61
• 3.2 病理變化61-70
• 4 討論70-71
• 參考文獻(xiàn)71-73
• 全文小結(jié)73-74
• 致謝74-75

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 盧建紅,劉秀梵,邵衛(wèi)星,張?jiān)u滸,韋棟平;H9N2亞型禽流感病毒基因組全長(zhǎng)序列測(cè)定和各基因的遺傳分析[J];微生物學(xué)報(bào);2003年04期

2 程堅(jiān),劉紅旗,彭大新,張如寬,劉秀梵;兩株H_9亞型禽流感病毒HA基因序列分析[J];江蘇農(nóng)業(yè)研究;2001年01期

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本文編號(hào)：893000