本文關(guān)鍵詞：凋亡抑制劑在豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后凋亡模式研究中的應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 豬 卵母細(xì)胞 玻璃化冷凍 凋亡抑制劑 凋亡途徑 發(fā)育

【摘要】：豬卵母細(xì)胞內(nèi)由于存在大量脂肪顆粒,其冷凍保存現(xiàn)狀仍不理想,主要表現(xiàn)為冷凍復(fù)蘇后發(fā)育能力低。因此,研究豬卵母細(xì)胞冷凍后損傷機(jī)制十分重要。在卵母細(xì)胞冷凍保存中,冷凍后復(fù)蘇過(guò)程中發(fā)生的細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是影響卵母細(xì)胞冷凍后發(fā)育能力的主要因素之一。然而關(guān)于豬卵母細(xì)胞冷凍后凋亡報(bào)道偏少,尤其是關(guān)于豬卵母細(xì)胞凋亡途徑的研究至今較少。本試驗(yàn)利用玻璃化冷凍技術(shù)冷凍豬卵母細(xì)胞,在冷凍復(fù)蘇后孵育過(guò)程中分別添加死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑中關(guān)鍵因子caspase 8和caspase 9的抑制劑,以及兩者共同作用途徑中的總caspase抑制劑,從而研究豬卵母細(xì)胞冷凍后凋亡途徑及抑制劑對(duì)豬卵母細(xì)胞凍后發(fā)育的改善作用。本次試驗(yàn)旨在加深對(duì)豬卵母細(xì)胞凍后凋亡機(jī)理的認(rèn)識(shí)及凋亡抑制劑在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞凋亡的應(yīng)用,并為提高豬卵母細(xì)胞凍后發(fā)育能力提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本試驗(yàn)主要包括2個(gè)部分:第一部分研究?jī)?nèi)容是通過(guò)將特異性凋亡抑制劑應(yīng)用于豬卵母細(xì)胞冷凍中,探討其凍后可能的細(xì)胞凋亡途徑。冷凍引起的凋亡是凍后豬卵母細(xì)胞發(fā)育下降的主要原因之一,但冷凍凋亡途徑還不甚了解。Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK和Z-DEVD-FMK分別是凋亡過(guò)程中死亡受體途徑、線粒體途徑及共同作用途徑的關(guān)鍵性凋亡因子caspase8、caspase9和caspase3的特異性抑制劑。為了進(jìn)一步了解豬MII期卵母細(xì)胞凍后凋亡途徑,本研究檢測(cè)了新鮮、冷凍、Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK和Z-DEVD-FMK組的早期凋亡情況,并利用原位熒光、JC-1和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)兩個(gè)凋亡途徑中關(guān)鍵蛋白和分子的活性與表達(dá)情況,以闡明豬卵母細(xì)胞凍后凋亡途徑。同時(shí)檢測(cè)了抑制劑的添加對(duì)卵母細(xì)胞凍后活性和發(fā)育能力的影響。研究結(jié)果顯示,1)冷凍造成卵母細(xì)胞早期凋亡,兩種抑制劑降低冷凍卵母細(xì)胞早期凋亡率(P0.05);2)與冷凍組相比,Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK和Z-DEVD-FMK均顯著降低冷凍卵母細(xì)胞中總caspase、caspase3,caspase8和caspase9的活性;3)冷凍后線粒體膜電位顯著降低(0.90 vs.1.33,P0.05),Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK和Z-DEVD-FMK添加能顯著提高線粒體膜電位(1.09、1.05和1.11);4)凍后Z-IETD-FMK的添加能改善死亡受體途徑中相關(guān)基因(caspase8和TNF-α)和線粒體途徑中相關(guān)基因(Bcl-2和CuZnSOD)的表達(dá),Z-LEHD-FMK的添加亦改變兩個(gè)凋亡途徑中相關(guān)基因的表達(dá),Z-DEVD-FMK能改善兩條途徑中凋亡基因的表達(dá);5)Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK和Z-DEVD-FMK顯著提高卵母細(xì)胞凍后存活率、卵裂率和囊胚率。第二部分研究?jī)?nèi)容是分析總caspase抑制劑Z-VAD-FMK對(duì)豬卵母細(xì)胞冷凍后凋亡及發(fā)育的影響。Z-VAD-FMK是一種caspase廣譜抑制劑,為了研究pan-caspase抑制劑Z-VAD-FMK在豬冷凍卵母細(xì)胞的作用,本文利用Annexin-V FITC、JC-1、caspase原位熒光染色分別檢測(cè)早期凋亡、線粒體膜電位和caspase水平,并利用相對(duì)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同凋亡途徑中相關(guān)基因的表達(dá)變化,同時(shí)檢測(cè)冷凍卵母細(xì)胞孤雌激活后的卵裂率和囊胚率。結(jié)果表明:Z-VAD-FMK組與冷凍組相比,細(xì)胞凋亡率和總caspase水平明顯降低(P0.05),線粒體膜電位明顯提高(P0.05),但與新鮮組相比,細(xì)胞凋亡率和總caspase水平仍舊明顯偏高(P0.05),線粒體膜電位明顯低(P0.05);冷凍后加Z-VAD-FMK組孤雌激活后其卵裂率和囊胚率明顯高于冷凍組(P0.05),低于新鮮組(P0.05);Z-VAD-FMK明顯降低冷凍細(xì)胞中caspase3、8、9,Bax,TNF-α等促凋亡基因水平(P0.05),抗凋亡基因Bcl-2和CuZnSOD表達(dá)水平明顯升高(P0.05)。結(jié)論:總之,凋亡抑制劑的添加從側(cè)面證實(shí)了死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑共同介導(dǎo)了凍后豬MII期卵母細(xì)胞凋亡的發(fā)生;凍后豬卵母細(xì)胞在Z-VAD-FMK中孵育2 h可以提高線粒體膜電位,抑制細(xì)胞凋亡,改善凋亡相關(guān)基因表達(dá),提高冷凍卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育能力。
【關(guān)鍵詞】：豬 卵母細(xì)胞 玻璃化冷凍 凋亡抑制劑 凋亡途徑 發(fā)育
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S828
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 引言12-21
• 1.1 種質(zhì)資源保存12-15
• 1.1.1 種質(zhì)資源保存的方法12-13
• 1.1.2 卵母細(xì)胞冷凍保存現(xiàn)狀13-14
• 1.1.3 卵母細(xì)胞冷凍保存困難14-15
• 1.2 細(xì)胞凋亡15-21
• 1.2.1 死亡受體途徑16
• 1.2.2 線粒體途徑16-17
• 1.2.3 哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞凋亡的研究現(xiàn)狀17-19
• 1.2.4 冷凍對(duì)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞凋亡的影響19
• 1.2.5 凋亡抑制劑在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用19-21
• 第二章 特異性凋亡抑制劑在冷凍豬卵母細(xì)胞凋亡途徑中的應(yīng)用21-38
• 2.1 材料21-26
• 2.1.1 主要試劑21-23
• 2.1.2 設(shè)備與耗材23-24
• 2.1.3 試劑的配制24-26
• 2.3 方法26-29
• 2.3.1 采集和體外成熟培養(yǎng)26
• 2.3.2 玻璃化冷凍和解凍26
• 2.3.3 早期凋亡的測(cè)定26-27
• 2.3.4 caspase水平的測(cè)定27
• 2.3.5 線粒體膜電位的測(cè)定27
• 2.3.6 總RNA提取27
• 2.3.7 反轉(zhuǎn)錄27-28
• 2.3.8 熒光定量PCR（ qRT- PCR）28
• 2.3.9 豬卵母細(xì)胞凍后存活率的測(cè)定28-29
• 2.3.10 冷凍豬卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的測(cè)定29
• 2.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)29
• 2.4 結(jié)果與分析29-35
• 2.4.1 凋亡抑制劑對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞早期凋亡的影響29-30
• 2.4.2 凋亡抑制劑對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞中caspase活性的影響30-32
• 2.4.3 凋亡抑制劑對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞線粒體膜電位的影響32-33
• 2.4.4 凋亡抑制劑對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞中凋亡基因表達(dá)的影響33-34
• 2.4.5 凋亡抑制劑對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞存活率和孤雌激活發(fā)育能力的影響34-35
• 2.5 討論35-37
• 2.6 小結(jié)37-38
• 第三章 凋亡抑制劑Z-VAD-FMK在豬卵母細(xì)胞冷凍保存中的應(yīng)用38-48
• 3.1 材料38
• 3.1.1 儀器38
• 3.1.2 主要試劑38
• 3.1.3 試劑配制38
• 3.2 方法38-40
• 3.2.1 采集和體外成熟培養(yǎng)38-39
• 3.2.2 玻璃化冷凍和解凍39
• 3.2.3 早期凋亡檢測(cè)39
• 3.2.4 caspase活性的檢測(cè)39
• 3.2.5 線粒體膜電位檢測(cè)39
• 3.2.6 總RNA提取39
• 3.2.7 反轉(zhuǎn)錄39
• 3.2.8 qRT- PCR39-40
• 3.2.9 凍后存活率的測(cè)定40
• 3.2.10 孤雌發(fā)育能力的測(cè)定40
• 3.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)40
• 3.3 結(jié)果與分析40-45
• 3.3.1 Z-VAD-FMK對(duì)豬冷凍卵母細(xì)胞早期凋亡率的影響40-41
• 3.3.2 Z-VAD-FMK對(duì)冷凍豬MII期卵母細(xì)胞內(nèi)caspase活性的影響41-42
• 3.3.3 Z-VAD-FMK處理對(duì)豬冷凍卵母細(xì)胞線粒體膜電位的影響42-43
• 3.3.4 Z-VAD-FMK對(duì)豬冷凍卵母細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響43-44
• 3.3.5 凍后Z-VAD-FMK對(duì)豬冷凍卵母細(xì)胞存活率和體外發(fā)育能力的影響44-45
• 3.4 討論45-46
• 3.5 小結(jié)46-48
• 參考文獻(xiàn)48-57
• 附錄57-59
• 致謝59-60
• 成果60

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