本文關(guān)鍵詞：牛乳頭狀瘤病毒13型L1基因的表達研究

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【摘要】：牛乳頭狀瘤病毒(bovine papillomavirus, BPV)可引起牛乳頭狀瘤(bovine papillomatosis, BP)慢性增生性疾病。BPV基因組包括三個區(qū)域：早期轉(zhuǎn)錄區(qū)(E區(qū))、晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)(L區(qū))和非編碼區(qū)(NCR)。其中,L區(qū)主要編碼衣殼蛋白,誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和性抗體,激發(fā)保護性免疫,是進行預(yù)防免疫的主要靶抗原。目前,對于BPV的免疫是建立在L1基因基礎(chǔ)上的病毒樣顆粒(VLP)預(yù)防性免疫,VLP雖具有較好的效果,但價格昂貴。本研究實驗一以BPV13基因組為模板,通過PCR技術(shù)擴增得到L1片段,同時用BamHⅠ和HindⅢ分別對目的片段和pET28a(+)載體進行雙酶切,將酶切后的L1基因片段克隆至原核表達載體pET28a(+),構(gòu)建pET28a-L1重組質(zhì)粒,雙酶切和測序鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),篩選最佳IPTG濃度和最佳誘導(dǎo)時間,進行誘導(dǎo)表達,以SDS-PAGE和Western blotting檢測。將表達的融合蛋白進行Ni-NTA柱純化后,用SDS-PAGE檢測純化的表達產(chǎn)物。結(jié)果表明：L1基因正確插入到原核表達載體pET28a(+)中；IPTG誘導(dǎo)后,含重組質(zhì)粒pET28a-L1的表達菌成功表達了帶His標(biāo)簽的融合蛋白,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,融合蛋白分子質(zhì)量為60 kDa,與預(yù)期大小一致,超聲破菌后,SDS-PAGE電泳顯示,融合蛋白存在于包涵體中；Western blotting驗證其為帶His標(biāo)簽的融合蛋白。實驗二用純化的融合蛋白皮下多點注射免疫大白兔,制備兔抗BPV13-L1多克隆抗體。用間接ELISA方法檢測多抗的效價,結(jié)果表明,獲得的抗體效價在1：25600以上。Western blotting分析顯示：此多抗具有較強的特異性。實驗三通過PCR反應(yīng)擴增L1基因,同時用Xho Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切目的片段和pEGFP-Nl真核載體,連接構(gòu)建重組表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞,進行熒光顯微鏡觀察, qRT-PCR檢測和Western blotting鑒定。結(jié)果表明：本實驗成功構(gòu)建了pEGFP-N1-L1重組質(zhì)粒,表達了L1融合蛋白,為BPV13疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：牛乳頭狀瘤病毒 L1基因 原核表達 純化 多克隆抗體 真核表達
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 引言9-20
• 1 前言9
• 2 BPV9-17
• 2.1 BPV的類型9-11
• 2.2 BPV基因組結(jié)構(gòu)特點11-16
• 2.3 BPV的致病機制和免疫機理16
• 2.4 不同BPV所致的腫瘤類型16-17
• 3 BP的流行病學(xué)17
• 4 BP的診斷與防治17-19
• 4.1 BP的診斷17-18
• 4.2 BP的防治18-19
• 5 研究目的與意義19-20
• 第二章 BPV13 L1基因的克隆、原核表達及純化20-39
• 1 實驗材料20-27
• 1.1 基因組、質(zhì)粒及菌株20
• 1.2 主要試劑20-21
• 1.3 實驗儀器設(shè)備21
• 1.4 主要試劑配制21-27
• 2 實驗方法27-33
• 2.1 原核表達質(zhì)粒pET28a-L1的構(gòu)建及鑒定27-30
• 2.2 原核表達質(zhì)粒pET28a-L1的表達及優(yōu)化30-31
• 2.3 重組表達蛋白的純化和鑒定31-33
• 3 實驗結(jié)果33-37
• 3.1 L1基因PCR結(jié)果33-34
• 3.2 菌落PCR鑒定原核表達質(zhì)粒pET28a-L134
• 3.3 pET28a-L1重組質(zhì)粒雙酶切鑒定及測序34-35
• 3.4 原核表達質(zhì)粒pET28a-L1的誘導(dǎo)表達及表達條件優(yōu)化35
• 3.5 L1重組蛋白的可溶性分析35-36
• 3.6 L1重組蛋白的純化36
• 3.7 L1重組蛋白的Western blotting分析36-37
• 4 討論37-39
• 第三章 兔抗BPV13-L1多克隆抗體的制備和應(yīng)用39-45
• 1 實驗材料39-40
• 1.1 主要實驗器械39
• 1.2 主要試劑39
• 1.3 實驗動物39
• 1.4 實驗儀器設(shè)備39-40
• 1.5 主要試劑配制40
• 2 實驗方法40-42
• 2.1 陰性血清采集40
• 2.2 免疫原的制備40-41
• 2.3 抗L1多克隆抗體的制備41
• 2.4 效價測定41-42
• 2.5 特異性鑒定42
• 3 實驗結(jié)果42-43
• 3.1 抗L1多克隆抗體效價檢測42
• 3.2 抗L1多克隆抗體特異性鑒定42-43
• 4 討論43-45
• 第四章 BPV13 L1蛋白在NIH3T3細胞中的表達45-58
• 1 實驗材料45-47
• 1.1 細胞、菌種和載體45
• 1.2 主要試劑45-46
• 1.3 實驗儀器設(shè)備46
• 1.4 主要試劑配制46-47
• 2 實驗方法47-53
• 2.1 真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1-L1的構(gòu)建及鑒定47-49
• 2.2 NIH3T3細胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)和凍存49
• 2.3 提取無內(nèi)毒素真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1-L149-50
• 2.4 脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-N1-L1轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞50-51
• 2.5 重組蛋白EGFP-L1的表達檢測51-53
• 3 實驗結(jié)果53-57
• 3.1 L1基因PCR結(jié)果53-54
• 3.2 真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1-L1的雙酶切鑒定及測序54
• 3.3 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細胞綠色熒光蛋白表達54-55
• 3.4 熒光定量PCR檢測EGFP-L1融合蛋白的表達55-56
• 3.5 Western blotting檢測EGFP-L1融合蛋白的表達56-57
• 4 討論57-58
• 第五章 結(jié)論58-59
• 參考文獻59-69
• 縮略詞69-70
• 致謝70-71
• 附錄71-74

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 趙天靖;賈曉曉;史巧蕓;郭蒔雨;龐峰;朱華培;徐開蓮;李亞穎;彭冬梅;李國華;王鳳陽;;牛乳頭狀瘤病毒13型L1基因的克隆及原核表達[J];中國畜牧獸醫(yī);2015年09期

2 史巧蕓;龐峰;杜麗;王鳳陽;;牛乳頭瘤病毒的研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2015年06期

3 賀志昊;劉賢俠;喬軍;孟慶玲;張再超;楊海波;陳創(chuàng)夫;都曼·努爾坎杰;;奶牛乳頭狀瘤病理學(xué)診斷及病原分子檢測研究[J];石河子大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2013年06期

4 張鶴曉,劉繼紅,劉環(huán),郭晉優(yōu),谷強;牛陰莖纖維乳頭狀瘤的檢疫技術(shù)及防止傳入對策[J];檢驗檢疫科學(xué);2002年04期

5 董國偉,王沫,劉賢進,余向陽;兔抗甲胺磷多克隆抗體的制備[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2001年04期

6 袁世山;牛乳頭狀瘤病毒研究進展[J];動物檢疫;1989年01期

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本文編號：888062