本文關(guān)鍵詞：呂氏泰勒蟲TISP蛋白與綿羊淋巴細胞互作蛋白的酵母雙雜交系統(tǒng)篩選

  更多相關(guān)文章： 呂氏泰勒蟲 TISP蛋白 綿羊淋巴細胞 酵母雙雜交系統(tǒng) 原核表達 免疫共沉淀

【摘要】：呂氏泰勒蟲是經(jīng)蜱傳播的寄生于綿羊和山羊巨噬細胞、淋巴細胞和紅細胞內(nèi)的泰勒科泰勒屬的一種血液性原蟲。TlSP蛋白是呂氏泰勒蟲在子孢子、裂殖體及裂殖子三個階段中共有的一種膜蛋白。呂氏泰勒蟲TlSP基因與環(huán)形泰勒蟲TaSP基因在核苷酸水平上相似性為97%。大量數(shù)據(jù)顯示TaSP蛋白在環(huán)形泰勒蟲入侵牛淋巴細胞和使牛淋巴細胞永生化中發(fā)揮重要的作用,證明其是寄生蟲侵襲宿主細胞的主要蛋白。我們推測,TlSP蛋白在呂氏泰勒蟲入侵綿羊和山羊等宿主動物中也應(yīng)該發(fā)揮類似的作用。本研究以TlSP蛋白為誘餌蛋白,利用酵母雙雜交技術(shù)從羊淋巴細胞文庫中調(diào)出與其相互作用的蛋白,通過研究相互作用蛋白的功能,探究出呂氏泰勒蟲TlSP蛋白與蟲體入侵宿主細胞的關(guān)系。在酵母雙雜交篩選蛋白前,以健康綿羊外周淋巴細胞構(gòu)建酵母雙雜交文庫,結(jié)果顯示該文庫的細胞密度為1.08x109個/mL,插入片段長度位于250～2000 bp之間,文庫滴度為1.09x 108 CFU,重組率為92%,通過測序分析到該文庫包括11種以上的淋巴細胞蛋白。對pGBKT7-TlSP誘餌菌的毒性和自啟動性進行檢測,顯示該誘餌對酵母菌沒有毒性,且其本身不存在自啟動性,TlSP蛋白可以作為酵母雙雜交的誘餌蛋白。以TlSP蛋白綿羊免疫血清為一抗,將pGBKT7-TlSP誘餌菌的全蛋白進行Western-blotting.后,發(fā)現(xiàn)TlSP蛋白在酵母中能正常表達,其反應(yīng)原性良好。以pGBKT7-TlSP酵母菌為誘餌,對羊淋巴細胞酵母雙雜交文庫進行雜交篩選,結(jié)果共篩選到9種蛋白,利用生物信息學(xué)分析顯示這些蛋白大多為核糖體蛋白和剪接體,主要參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯、細胞增殖、分化和凋亡等過程。將篩選到的核糖體蛋白S20和TlSP蛋白分別通過雙酶切連接于pGEX-4T-1和pET-30a表達載體。將pET-30a-TlSP重組蛋白通過鎳柱純化,與pGEX-4T-1-S20重組蛋白進行免疫共沉淀試驗后,通過Western-blotting顯示核糖體蛋白S20和TlSP蛋白之間確實存在蛋白的相互作用。本研究通過分析用酵母雙雜交技術(shù)篩選與TlSP互作蛋白的作用,證明TlSP蛋白與TaSP蛋白一樣,與其在宿主細胞內(nèi)的增殖相關(guān),其詳細的生物學(xué)功能有待進一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：呂氏泰勒蟲 TISP蛋白 綿羊淋巴細胞 酵母雙雜交系統(tǒng) 原核表達 免疫共沉淀
【學(xué)位授予單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.26
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第1章 前言11-22
• 1.1 羊泰勒蟲病的概況11-15
• 1.1.1 羊泰勒蟲的分類11
• 1.1.2 羊泰勒蟲生活史11-12
• 1.1.3 臨床癥狀及病理變化12-13
• 1.1.4 羊泰勒蟲宿主多樣性13
• 1.1.5 流行病學(xué)特點13-14
• 1.1.6 預(yù)防和治療14-15
• 1.2 羊泰勒蟲蛋白組學(xué)的概況15-16
• 1.2.1 尤氏泰勒蟲TuIP蛋白和Tu88蛋白15
• 1.2.2 尤氏泰勒蟲OPRT蛋白15-16
• 1.2.3 羊泰勒蟲表面蛋白P32和T1SP蛋白16
• 1.3 環(huán)形泰勒蟲裂殖體TaSP蛋白16-19
• 1.4 酵母雙雜交系統(tǒng)研究進展19-21
• 1.4.1 酵母雙雜交的原理19-20
• 1.4.2 酵母雙雜交的特點及應(yīng)用20-21
• 1.5 本研究的目的和意義21-22
• 第2章 正常羊淋巴細胞酵母雙雜交文庫的構(gòu)建22-30
• 2.1 材料與方法22-25
• 2.1.1 實驗動物22
• 2.1.2 主要試劑及其配制22
• 2.1.3 主要儀器22
• 2.1.4 正常羊淋巴細胞的制備22-23
• 2.1.5 羊淋巴細胞總RNA的提取23
• 2.1.6 羊淋巴細胞ds cDNA的合成及純化23-24
• 2.1.7 酵母菌Y187感受態(tài)細胞的制備24
• 2.1.8 酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建24-25
• 2.1.9 文庫質(zhì)量的評價25
• 2.2 結(jié)果25-28
• 2.2.1 正常羊淋巴細胞總RNA的提取25-26
• 2.2.2 雙鏈cDNA的擴增及其純化26-27
• 2.2.3 酵母雙雜交文庫質(zhì)量的鑒定27-28
• 2.3 小結(jié)與分析28-30
• 第3章 酵母雙雜交pGBKT7-T1SP誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定30-37
• 3.1 材料與方法30-33
• 3.1.1 菌株30
• 3.1.2 主要試劑及其配制30
• 3.1.3 主要儀器30-31
• 3.1.4 構(gòu)建pGBKT7-T1SP誘餌載體31-32
• 3.1.5 酵母Y2H株感受態(tài)細胞的制備32
• 3.1.6 誘餌pGBKT7-T1SP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化32
• 3.1.7 誘餌pGBKT7-T1SP質(zhì)粒的細胞毒性檢測32
• 3.1.8 誘餌pGBKT7-T1SP質(zhì)粒的自啟動性檢測32
• 3.1.9 誘餌pGBKT7-T1SP質(zhì)粒真核表達反應(yīng)原性檢測32-33
• 3.2 結(jié)果33-35
• 3.2.1 重組pGBKT7-T1SP質(zhì)粒的構(gòu)建33
• 3.2.2 重組pGBKT7-T1SP質(zhì)粒細胞毒性檢測33-34
• 3.2.3 重組pGBKT7-T1SP質(zhì)粒自啟動性檢測34
• 3.2.4 重組pGBKT7-T1SP質(zhì)粒蛋白的反應(yīng)原性檢測34-35
• 3.3 小結(jié)與分析35-37
• 第4章 酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與T1SP相互作用的蛋白37-43
• 4.1 材料與方法37-39
• 4.1.1 菌株37
• 4.1.2 主要試劑37
• 4.1.3 主要儀器37
• 4.1.4 酵母雙雜交系統(tǒng)互作蛋白對照實驗37
• 4.1.5 用pGBKT7-T1SP菌株從羊淋巴細胞酵母雙雜交文庫中篩選相互作用蛋白37-38
• 4.1.6 陽性克隆測序鑒定38
• 4.1.7 回交驗證38-39
• 4.2 結(jié)果39-42
• 4.2.1 對照實驗39
• 4.2.2 篩選與T1SP蛋白互作的羊淋巴細胞蛋白39-40
• 4.2.3 陽性質(zhì)粒測序結(jié)果40-41
• 4.2.4 回交驗證41-42
• 4.3 小結(jié)與分析42-43
• 第5章 GST Pull-down法驗證S20蛋白與T1SP蛋白的相互作用43-48
• 5.1 材料與方法43-45
• 5.1.1 主要試劑及其配制43
• 5.1.2 主要儀器43
• 5.1.3 pGEX-4T-1-S20表達載體的構(gòu)建43-44
• 5.1.4 pET-30a-T1SP蛋白的純化44
• 5.1.5 pGEX-4T-1-S20重組蛋白的誘導(dǎo)表達44
• 5.1.6 Pull-down法驗證互作蛋白44-45
• 5.2 結(jié)果45-47
• 5.2.1 pGEX-4T-1-S20重組蛋白的誘導(dǎo)表達45
• 5.2.2 Pull-down法驗證互作蛋白45-47
• 5.3 小結(jié)與分析47-48
• 第6章 全文結(jié)論48-49
• 參考文獻49-56
• 附錄56-58
• 作者簡介58
• 碩士生期間發(fā)表論文情況58-59
• 致謝59

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3 王，

本文編號：883136