本文關(guān)鍵詞：豬過敏毒素C5a的DNA適配體篩選和評(píng)價(jià)

  更多相關(guān)文章： 豬過敏毒素C5a 單鏈DNA適配體 毛細(xì)管電泳SELEX

【摘要】：過敏毒素C5a是補(bǔ)體系統(tǒng)級(jí)聯(lián)活化過程中產(chǎn)生的一個(gè)小片段蛋白,釋放到血液中,具有免疫調(diào)節(jié)作用。同時(shí),C5a也是重要的前炎癥性介質(zhì),與炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。C5aR廣泛分布在髓樣細(xì)胞表面,C5a與細(xì)胞表面C5aR結(jié)合,釋放組織胺、血管活化因子、自由基及白細(xì)胞介素IL-6、IL-8等,導(dǎo)致平滑肌收縮、血管通透性增加。此外,高濃度的C5a是中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化劑,可誘導(dǎo)細(xì)胞順濃度梯度方向移動(dòng)。機(jī)體出現(xiàn)炎癥時(shí),血液中的C5a濃度增加,引起PMN在血管內(nèi)皮位置聚集,進(jìn)而穿過內(nèi)皮向組織浸潤(rùn),誘導(dǎo)產(chǎn)生并釋放大量的炎癥介質(zhì),導(dǎo)致血管內(nèi)功能不全,使炎癥加重。研究證實(shí)過敏毒素C5a在機(jī)體許多疾病的病理過程中參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展,所以研究炎癥介質(zhì)C5a不僅對(duì)揭示炎癥反應(yīng)過程中的分子機(jī)制有重要的意義,而且對(duì)于尋求、開發(fā)有效的C5a拮抗劑控制其在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等病理過程中的作用,對(duì)于多種炎性疾病的治療和轉(zhuǎn)歸具有重大臨床價(jià)值,而研發(fā)豬C5a適配體拮抗劑作為新型養(yǎng)殖動(dòng)物廣譜抗炎藥在獸醫(yī)領(lǐng)域同樣具有重大影響。諸多研究者意識(shí)到用阻斷C5a與其受體(C5aR/CD88)結(jié)合的方法抑制炎癥反應(yīng)是極具臨床應(yīng)用前景的抗炎新途徑,然而抗體類抑制劑制備難度大、成本高、反復(fù)使用容易使機(jī)體出現(xiàn)過敏反應(yīng)等,探索與抗C5a抗體作用原理相似,而且更加便宜、安全、活性穩(wěn)定的拮抗劑成為抗炎新思路。適配體是一類能特異性地與各類生物靶標(biāo)以高親和力相結(jié)合的單鏈DNA或RNA,作用原理類似于抗體,通過兩者結(jié)合從而抑制受體靶標(biāo)的生物活性,另外適配體易制備易修飾的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)可彌補(bǔ)C5a抗體在臨床治療上的缺陷,適配體最大的優(yōu)點(diǎn)是沒有免疫原性,故在臨床用藥時(shí)能重復(fù)使用;隨著適配體在醫(yī)學(xué),生命科學(xué)等領(lǐng)域的研究和在疾病的診斷與治療上的應(yīng)用,拮抗C5a活性適配體的篩選也成為了研究的熱點(diǎn),因此,為了開發(fā)探索豬炎癥性疾病新型廣譜治療藥物,篩選豬C5a的核酸適配體是非常有必要的。本論文采用毛細(xì)管電泳篩選策略,以豬C5a為靶標(biāo)進(jìn)行單鏈DNA適配體的篩選;并且對(duì)篩選得到的適配體的親和力和拮抗活性進(jìn)行了考察。研究?jī)?nèi)容主要包括:(1)原核表達(dá)豬C5a蛋白。試驗(yàn)內(nèi)容:(1)將豬C5a蛋白基因分別克隆入pET32a和pET28a表達(dá)載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET32a-C5a和pET28a-C5a,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落,提取重組質(zhì)粒,進(jìn)行一系列鑒定;(2)以sds-page及westernblotting等方法鑒定重組質(zhì)粒是否成功表達(dá)豬c5a蛋白。(3)將鑒定正確的菌株大量培養(yǎng),進(jìn)行iptg誘導(dǎo)表達(dá)。(4)利用銅柱親和層析技術(shù)純化含有組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白。(5)利用豬中性粒細(xì)胞趨化及誘導(dǎo)試驗(yàn)鑒定目的蛋白的生物活性。(2)豬c5a的單鏈dna適配體篩選和評(píng)價(jià)。(1)將具有生物活性的重組豬c5a蛋白作為靶標(biāo),選用基于ce的高效分離能力的ce-selex技術(shù),將未結(jié)合序列與結(jié)合復(fù)合物分離,經(jīng)過六輪篩選,最終獲得能與該蛋白具有較高結(jié)合力的dna適配體序列組。(2)以高通量測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行候選適配體的結(jié)構(gòu)解析;(3)通過emsa和spr技術(shù)測(cè)定適配體與c5a蛋白結(jié)合的親和力和特異性;(4)最后利用體外細(xì)胞趨化試驗(yàn)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)適配體s1拮抗豬c5a生物活性的能力。通過上述兩大部分試驗(yàn),獲得了以下結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了pet32a-c5a和pet28a-c5a兩株重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染大腸桿菌bl21后優(yōu)化其誘導(dǎo)條件,成功獲得了大量表達(dá)豬c5a蛋白的菌株,通過銅柱親和層析純化蛋白,sds-page和western-blotting檢測(cè)分析表明,重組豬c5a蛋白獲得表達(dá),重組蛋白大小為10,000,純化后豬c5a蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定,其一級(jí)結(jié)構(gòu)正確,純度達(dá)到90%以上,濃度為2.5g/l。體外細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)到c5a具有趨化和誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的活性,為下一步大量純化豬c5a蛋白用于適配體篩選奠定了基礎(chǔ)。(2)豬c5a單鏈dna適配體的篩選結(jié)果顯示,經(jīng)過六輪篩選,從毛細(xì)管電泳峰圖上可以看出靶標(biāo)蛋白與核酸復(fù)合物峰圖,候選序列高通量測(cè)序獲得55000多條序列,序列統(tǒng)計(jì)比對(duì)分析后挑選出的六條代表序列與c5a親和力測(cè)定,適配體s1顯示出高親和力和結(jié)合特異性,kd值為4.81μm。通過體外中性粒細(xì)胞趨化試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)適配體s1和s2均可以抑制豬c5a的趨化活性,流式細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果得出適配體s1能夠抑制c5a與豬中性粒細(xì)胞表面c5ar的結(jié)合,從而抑制其活性作用。通過以上結(jié)果,得出如下4條結(jié)論:(1)成功構(gòu)建了pet32a-c5a和pet28a-c5a兩株豬c5a蛋白基因的原核表達(dá)系統(tǒng),純化獲得的豬c5a蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定,其一級(jí)結(jié)構(gòu)正確,體外細(xì)胞試驗(yàn)證明其具有生物活性,為下一步適配體篩選奠定了基礎(chǔ)。(2)建立了篩選豬c5a核酸適配體的高效篩選條件;ce-selex技術(shù)結(jié)合高通量測(cè)序和spr技術(shù),針對(duì)豬c5a蛋白快速高效的篩選到特異性結(jié)合的適配體。(3)初步建立適配體高通量測(cè)序大數(shù)據(jù)的分析流程,不僅提高了篩選效率,而且避免了傳統(tǒng)lts單點(diǎn)測(cè)序,可能錯(cuò)失更優(yōu)適配體的缺點(diǎn)。本試驗(yàn)通過序列分析軟件,將大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分類,更有目標(biāo)性的挑選候選適配體。(4)體外細(xì)胞趨化試驗(yàn)中,適配體S1和S2均可有效抑制C5a誘導(dǎo)的豬中性粒細(xì)胞的趨化,拮抗能力相比,S1比S2強(qiáng),更有治療豬C5a介導(dǎo)的炎性疾病的潛力。論文創(chuàng)新點(diǎn):1.首次通過原核表達(dá)獲得有活性的豬C5a蛋白,在獸醫(yī)領(lǐng)域?yàn)樯钊胙芯緾5a致炎機(jī)理奠定基礎(chǔ),同時(shí)為其拮抗劑的研發(fā)提供條件。2.建立了毛細(xì)管篩選技術(shù),用于豬C5a適配體的高效篩選,并獲得了能夠體外拮抗C5a生物活性的適配體S1,為開發(fā)豬適配體類廣譜抗炎藥物提供了可能性。
【關(guān)鍵詞】：豬過敏毒素C5a 單鏈DNA適配體 毛細(xì)管電泳SELEX
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 第一章 豬C5a蛋白原核表達(dá)、純化及生物學(xué)活性檢測(cè)14-31
• 1 材料與方法14-23
• 1.1 材料14-16
• 1.2 方法16-23
• 2 結(jié)果23-29
• 2.1 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建23-25
• 2.2 原核表達(dá)載體pET32a-C5a蛋白表達(dá)的SDS-PAGE和dot bolt鑒定25-26
• 2.3 原核表達(dá)載體pET28a-C5a蛋白表達(dá)的SDS-PAGE和western boltting鑒定26-27
• 2.4 C5a重組表達(dá)蛋白樣品質(zhì)譜鑒定27-28
• 2.5 C5a蛋白的生物活性檢測(cè)28-29
• 3 討論29-30
• 4 小結(jié)30-31
• 第二章 豬C5a的適配體篩選和評(píng)價(jià)31-50
• 1 材料與方法32-38
• 1.1 材料32-33
• 1.2 方法33-38
• 2 結(jié)果38-46
• 2.1 ssDNA文庫PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化38
• 2.2 豬C5a適配體的毛細(xì)管電泳-SELEX篩選38-39
• 2.3 適配體測(cè)序和序列分析39-42
• 2.4 適配體親和力和特異性評(píng)價(jià)42-44
• 2.5 適配體穩(wěn)定性分析44-45
• 2.6 適配體抑制C5a蛋白的生物活性評(píng)價(jià)45-46
• 3 討論46-50
• 3.1 篩選適配體作為拮抗劑47
• 3.2 篩選豬C5a的單鏈DNA適配體47-48
• 3.3 不同種屬C5a蛋白和適配體的比對(duì)分析48-49
• 3.4 適配體篩選的影響因素49-50
• 4 小結(jié)50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷54-55
• 致謝55

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