本文關(guān)鍵詞：野鴿皰疹病毒的分離鑒定及UL27基因生物信息學(xué)分析

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【摘要】：禽皰疹病毒感染廣泛存在于多種鳥(niǎo)類之中,能引起雞、鴨等禽類感染。目前,禽皰疹病毒的感染呈現(xiàn)多樣化,不再局限于家禽體內(nèi),在鴿子體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)感染。自然感染野鴿臨床表現(xiàn)為厭食、精神不振、結(jié)膜炎；剖檢可見(jiàn)上呼吸道發(fā)炎,嚴(yán)重者潰瘍,肝臟、脾臟、腎臟及胰臟壞死,肝臟表面可見(jiàn)小的壞死點(diǎn)；組織病理學(xué)檢查顯示肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)核內(nèi)包涵體,肝臟、腎臟、脾臟及胰臟大量壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。鴿子是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一,皰疹病毒對(duì)養(yǎng)鴿業(yè)造成較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。鴿皰疹病毒(Pigeon herpesvirus, PiHV)又稱哥倫比亞皰疹病I型(Columbid herpesvirus 1, CoHV-1),屬于禽皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科馬立克氏病毒屬成員。該病首次爆發(fā)于1945年,目前已在世界范圍內(nèi)流行,成為危害養(yǎng)鴿業(yè)發(fā)展的主要傳染病之一。2013年,康達(dá)畜禽咨詢服務(wù)中心收到黑龍江省內(nèi)的患病野鴿子病例。本研究通過(guò)對(duì)自然發(fā)病野鴿的流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、以及病毒的分離純化和理化特性檢驗(yàn)、動(dòng)物回歸試驗(yàn)和基因檢測(cè)分析證明該病病原為CoHV-1。這是我國(guó)首次在野鴿(Columba livia f. dom)中成功分離得到CoHV-1。UL27基因編碼的gB蛋白是皰疹病毒感染過(guò)程中的主要囊膜糖蛋白。因此,研究鴿皰疹病毒UL27基因?qū)ζ浞肿由飳W(xué)功能意義重大,同時(shí)對(duì)臨床上診斷、預(yù)防鴿皰疹病毒及其基因工程疫苗起著指導(dǎo)作用。本研究以CoHV-1-HLJ基因組為模板,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,并結(jié)合步移PCR的技術(shù),獲得了CoHV-1-HLJ UL25、UL26、UL27基因序列,DNA序列分析得到的對(duì)應(yīng)的開(kāi)放閱讀框(ORF)大小分別為1755bp、2328bp、2788bp；編碼的氨基酸(aa)個(gè)數(shù)分別為584aa、775aa、995aa；UL27基因序列提交GenBank對(duì)應(yīng)的登陸號(hào)為：KU051711。分析CoHV-1-HLJ gB蛋白抗原性,在gB蛋白胞外區(qū)抗原性較好的區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物,克隆到表達(dá)載體pET28a(+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-CoHV-gB,將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21(DE3)中,得到大量的以包涵體形式表達(dá)的目的蛋白,SDS-PAGE可見(jiàn)蛋白大小約為37.5 kDa。重組蛋白能夠與本實(shí)驗(yàn)室制備的兔抗CoHV-1-HLJ病毒粒子免疫血清發(fā)生特異性反應(yīng)。綜上所述,本研究為國(guó)內(nèi)首次從野鴿(家養(yǎng)鴿子野外馴化)體內(nèi)分離出一株鴿源皰疹病毒CoHV-1-HLJ, CoHV-1-HLJ感染鴿子后,臨床上表現(xiàn)為呼吸抑制和結(jié)膜炎,解剖病理變化為肝臟、腎臟、脾臟及胰臟壞死及感染臟器內(nèi)(肝臟)可見(jiàn)嗜酸性核內(nèi)包涵體；pET28a-CoHV-gB是野鴿皰疹病毒UL27基因的主要抗原區(qū)域(231-510aa)。本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行有助于了解目前中國(guó)CoHV-1-HLJ的分子流行情況,為今后CoHV-1-HLJ疫苗株的篩選及CoHV-1-HLJ的診斷防控提供了參考。
【關(guān)鍵詞】：鴿皰疹病毒 核內(nèi)包涵體 UL27基因 gB蛋白 主要抗原區(qū)域
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 前言10-20
• 1.1 皰疹病毒科概述10-16
• 1.1.1 皰疹病毒的分類10
• 1.1.2 皰疹病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)10-11
• 1.1.3 皰疹病毒復(fù)制11-13
• 1.1.4 皰疹病毒的基因組結(jié)構(gòu)13-14
• 1.1.5 皰疹病毒編碼的蛋白14-15
• 1.1.6 實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)15-16
• 1.2 禽皰疹病毒科概述16
• 1.3 皰疹病毒UL27基因及其編碼的糖蛋白B的研究進(jìn)展16-19
• 1.3.1 皰疹病毒UL27基因的特點(diǎn)及作用16-17
• 1.3.2 UL27基因編碼的gB的結(jié)構(gòu)特征17
• 1.3.3 gB的生物學(xué)特性及病毒感染中的作用機(jī)理17-18
• 1.3.4 gB蛋白在預(yù)防及診斷方面的研究18-19
• 1.4 研究的目的與意義19-20
• 2 研究的主要內(nèi)容20-37
• 2.1 試驗(yàn)材料20-22
• 2.1.1 病料來(lái)源20
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20
• 2.1.3 質(zhì)粒及菌株20
• 2.1.4 引物20
• 2.1.5 主要試劑及抗體20-21
• 2.1.6 主要儀器21-22
• 2.2 野鴿皰疹病毒的分離鑒定22-27
• 2.2.1 臨床病例的流行病學(xué)、臨床癥狀及組織病理學(xué)觀察22
• 2.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)22
• 2.2.3 病毒分離培養(yǎng)22-23
• 2.2.4 血凝試驗(yàn)23
• 2.2.5 病毒鑒定23-24
• 2.2.6 PCR檢測(cè)24-26
• 2.2.7 分離病毒的理化特性試驗(yàn)26-27
• 2.3 肉鴿回歸試驗(yàn)27-28
• 2.4 鴿皰疹病毒UL27基因的克隆28-32
• 2.4.1 鴿皰疹病毒UL27基因保守序列的克隆28
• 2.4.2 鴿皰疹病毒UL27基因上游PUL28-UL27序列的克隆28-29
• 2.4.3 鴿皰疹病毒UL27基因下游UL27-PUL26序列的克隆29-31
• 2.4.4 鴿皰疹病毒UL27基因序列拼接31
• 2.4.5 鴿皰疹病毒UL27基因序列的校對(duì)31-32
• 2.5 鴿皰疹病毒UL27基因的序列分析32
• 2.6 鴿皰疹病毒UL27基因及其編碼的gB蛋白的生物信息學(xué)分析32
• 2.6.1 UL27基因的核苷酸序列同源性分析32
• 2.6.2 UL27基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析32
• 2.6.3 gB蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)32
• 2.6.4 gB蛋白的抗原性分析32
• 2.7 鴿皰疹病毒gB蛋白主要抗原區(qū)域的原核表達(dá)、純化及抗體制備32-37
• 2.7.1 PCR擴(kuò)增鴿皰疹病毒gB蛋白主要抗原區(qū)域及鑒定32-34
• 2.7.2 主要抗原域蛋白pET28a-CoHV-gB的表達(dá)34-35
• 2.7.3 主要抗原域蛋白pET28a-CoHV-gB包涵體純化35
• 2.7.4 重組蛋白pET28a-CoHV-gB的復(fù)性35
• 2.7.5 兔抗CoHV-1-HLJ病毒粒子高免血清的制備35-36
• 2.7.6 主要抗原區(qū)域表達(dá)產(chǎn)物的Western-Blotting分析36-37
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-59
• 3.1 鴿皰疹病毒的分離鑒定結(jié)果37-40
• 3.1.1 臨床病例的流行病學(xué)、臨床癥狀及組織病理學(xué)觀察結(jié)果37
• 3.1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果37-38
• 3.1.3 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果38
• 3.1.4 血凝試驗(yàn)結(jié)果38
• 3.1.5 病毒電鏡結(jié)果38-39
• 3.1.6 PCR檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果39
• 3.1.7 理化特性試驗(yàn)結(jié)果39-40
• 3.2 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)結(jié)果40
• 3.3 鴿皰疹病毒UL27基因保守序列的克隆結(jié)果40-44
• 3.3.1 鴿皰疹病毒UL27基因序列克隆技術(shù)路線及引物40-41
• 3.3.2 UL27基因保守序列的簡(jiǎn)并引物DP1和DP2設(shè)計(jì)41-42
• 3.3.3 UL27基因保守序列PCR擴(kuò)增、純化及重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果42-43
• 3.3.4 UL27基因保守序列測(cè)定結(jié)果43-44
• 3.4 鴿皰疹病毒UL27基因上游PUL28-UL27序列的克隆結(jié)果44-46
• 3.4.1 UL28基因內(nèi)簡(jiǎn)并引物DP3設(shè)計(jì)44
• 3.4.2 PUL28-UL27序列的PCR擴(kuò)增、純化及重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果44-45
• 3.4.3 UL27基因上游PUL28-UL27序列測(cè)定結(jié)果45-46
• 3.5 鴿皰疹病毒UL27基因下游UL27-PUL26序列的克隆結(jié)果46-49
• 3.5.1 UL27基因下游UL27-PUL26序列的PCR擴(kuò)增、純化及重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果46-47
• 3.5.2 UL27基因下游UL27-PUL26序列測(cè)定結(jié)果47-49
• 3.6 鴿皰疹病毒UL27基因及其編碼gB蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果49-56
• 3.6.1 UL27基因序列校對(duì)后ORF預(yù)測(cè)結(jié)果49
• 3.6.2 UL27基因的核苷酸序列及其編碼gB蛋白的氨基酸序列分析49-51
• 3.6.3 UL27基因的核苷酸序列同源性分析51-52
• 3.6.4 gB蛋白保守區(qū)分析結(jié)果52
• 3.6.5 gB蛋白氨基酸序列同源性分析52-53
• 3.6.6 gB蛋白氨基酸序列結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析53-56
• 3.7 鴿皰疹病毒gB蛋白主要抗原區(qū)域的表達(dá)56-57
• 3.7.1 主要抗原區(qū)域的PCR擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定56-57
• 3.7.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)57
• 3.8 兔抗CoHV-1-HLJ病毒粒子的多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定57-58
• 3.9 重組蛋白pET28a-CoHV-gB表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot鑒定58-59
• 4 討論59-62
• 4.1 鴿皰疹病毒流行特點(diǎn)59
• 4.2 鴿皰疹病毒的UL27基因克隆59-60
• 4.3 鴿皰疹病毒的UL27基因及其編碼的gB蛋白的分子特征60-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-72
• 附錄72-76
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文76-78
• 致謝78-80

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本文編號(hào)：872539