本文關(guān)鍵詞：ELP融合犬β干擾素的表達(dá)、純化、抗病毒活性及體外半衰期研究

  更多相關(guān)文章： 犬重組β干擾素 類彈性蛋白多肽 融合表達(dá) 分離純化 抗病毒活性

【摘要】：盡管犬疫苗接種較為普遍,但由于疫苗質(zhì)量、使用方法和病毒變異等原因,犬細(xì)小病毒病、犬瘟熱、犬病毒性肝炎等傳染病流行仍較普遍。Ⅰ型干擾素(interferon,IFN)是具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子,其中犬重組α干擾素(CaIFN-α)廣泛用于犬病毒病的治療,并取得良好的治療效果。但現(xiàn)有的犬重組α干擾素多為組氨酸標(biāo)簽融合蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá),需要經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和親和層析法純化,不僅價(jià)格較高,而且體內(nèi)半衰期較短。延長(zhǎng)干擾素體內(nèi)半衰期的主要策略有聚乙二醇化和與血清白蛋白等進(jìn)行融合表達(dá),前者的反應(yīng)條件和產(chǎn)品質(zhì)量較難控制,后者仍需親和層析等方法純化。類彈性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)是一類根據(jù)體內(nèi)彈性蛋白重復(fù)序列合成的五肽聚合物,具有溫度敏感的可逆相變特性,可用離心等簡(jiǎn)單方法分離純化,因此ELP已被用作重組蛋白的純化標(biāo)簽。另外,ELP還被用作體內(nèi)藥物傳送載體,以起到緩釋和延長(zhǎng)半衰期作用。犬β干擾素(CalFN-β)與CalFN-α具有類似的抗病毒作用,但目前尚無(wú)基因工程產(chǎn)品上市。本研究用PCR擴(kuò)增CaIFN-β成熟肽編碼序列,分別將其插入原核表達(dá)載體pET-30a和ELP融合表達(dá)載體pET-ELP,獲得重組載體pET-CaIFNβ和pCaIFNβ-ELP。分別將重組載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌,在不同溫度下用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示：在37℃條件下His-CaIFNβ和CalFNβ-ELP融合蛋白均獲得正確表達(dá),但表達(dá)產(chǎn)物均為不可溶性包涵體。為了獲得可溶性表達(dá)產(chǎn)物,對(duì)兩種融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)溫度進(jìn)行了優(yōu)化,SDS-PAGE分析結(jié)果顯示：CaIFNp-ELP融合蛋白在低于30℃條件下主要以可溶性蛋白表達(dá),而His-CaIFNβ融合蛋白即使在20℃條件下仍以不溶性包涵體表達(dá),表明ELP可增加CaIFN-β的可溶性。在次基礎(chǔ)上對(duì)IPTG誘導(dǎo)CaIFNβ-ELP融合蛋白表達(dá)的濃度和時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果顯示：在20℃條件下,0.1～1.0 mM IPTG均能誘導(dǎo)CaIFNβ-ELP融合蛋白表達(dá),其中0.2 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的量較多,但差異不顯著；在6-24h時(shí)間內(nèi),CaIFNβ-ELP融合蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),誘導(dǎo)18h的表達(dá)量最高。這些研究結(jié)果為兩種融合蛋白的純化及抗病毒活性研究打下基礎(chǔ)。分別在優(yōu)化條件下進(jìn)行His-CaIFNβ和CaiFNp-ELP融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。His-CaiFNβ融合蛋白經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性后進(jìn)行鎳親和柱層析純化,結(jié)果顯示：融合蛋白純度為85%,產(chǎn)量為50 mg/L細(xì)菌培養(yǎng)。CaIFNβ-ELP融合蛋白用相變循環(huán)(ITC)純化,并對(duì)相變溫度、氯化鈉濃度和離心力等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果顯示：CaIFNβ-ELP融合蛋白的相變溫度為28℃,氯化鈉濃度為20 mol/L,適宜離心力為12000 g。用優(yōu)化ITC條件進(jìn)行CaIFNβ-ELP融合蛋白純化,純化產(chǎn)物用4 mol/L尿素溶解,透析后進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示：CaIFNβ-ELP融合蛋白的純度達(dá)96%,產(chǎn)量可達(dá)220mg/L。以MDCK細(xì)胞/水泡性口炎病毒系統(tǒng)進(jìn)行干擾素活性檢測(cè),結(jié)果顯示：His-CaIFNβ融合蛋白的抗病毒效價(jià)為104U/mg,CaIFNβ-ELP融合蛋白的抗病毒效價(jià)為105 U/mg。血清穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果顯示,CaIFNβ-ELP融合蛋白的體外半衰期大于24h,顯著高于His-CaIFNβ融合蛋白的12h。這些研究結(jié)果表明,ELP是有效的C aIFN-β表達(dá)和純化標(biāo)簽,純化的CaIFNβ-ELP融合蛋白具有較高的抗病毒活性和較長(zhǎng)的體外半衰期,有望用于犬病毒病的臨床治療。
【關(guān)鍵詞】：犬重組β干擾素 類彈性蛋白多肽 融合表達(dá) 分離純化 抗病毒活性
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;S858.292
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 符號(hào)說(shuō)明8-9
• 綜述一：犬干擾素研究進(jìn)展9-15
• 1 干擾素概述9-10
• 2 犬干擾素的作用及應(yīng)用10-12
• 3 干擾素的制備12-13
• 4 長(zhǎng)效干擾素研究13-14
• 5 結(jié)語(yǔ)14-15
• 綜述二：類彈性蛋白多肽及其在重組蛋白純化中的應(yīng)用15-23
• 1. 綜述15-17
• 2. 在重組蛋白純化中的應(yīng)用17-23
• 研究?jī)?nèi)容一：不同標(biāo)簽融合犬β干擾素的表達(dá)及條件優(yōu)化23-37
• 1. 材料與方法23-32
• 1.1 主要試劑23
• 1.2 載體與菌株23-24
• 1.3 溶液與培養(yǎng)基24-25
• 1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備25
• 1.5 目的基因PCR擴(kuò)增25-26
• 1.6 PCR產(chǎn)物純化26
• 1.7 目的片段與T載體連接26
• 1.8 感受態(tài)細(xì)胞制備26-27
• 1.9 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化27
• 1.10 重組子鑒定27-28
• 1.11 表達(dá)載體構(gòu)建28-29
• 1.12 融合蛋白表達(dá)29-32
• 2. 結(jié)果32-35
• 2.1 目的基因PCR擴(kuò)增32
• 2.2 表達(dá)載體鑒定32-33
• 2.3 融合干擾素表達(dá)分析33
• 2.4 誘導(dǎo)表達(dá)溫度優(yōu)化33-34
• 2.5 可溶性蛋白表達(dá)分析34-35
• 2.6 IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化35
• 3. 討論35-37
• 研究?jī)?nèi)容二：融合犬β干擾素的分離純化及抗病毒活性和體外半衰期比較37-48
• 1. 材料與方法37-42
• 1.1 試劑與耗材37
• 1.2 主要溶液37-38
• 1.3 主要儀器設(shè)備38
• 1.4 His-CaIFN β純化38
• 1.5 CaIFN β-ELP純化38-40
• 1.6 干擾素活性檢測(cè)40-42
• 1.7 干擾素血漿穩(wěn)定性檢測(cè)42
• 2. 結(jié)果42-46
• 2.1 His-CaIFN β純化42-43
• 2.2 CaIFNβ-ELP純化43-45
• 2.3 VSV滴度測(cè)定45
• 2.4 融合干擾素活性測(cè)定45
• 2.5 間接免疫熒光45-46
• 2.6 干擾素血漿穩(wěn)定性46
• 3. 討論46-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 致謝54-55

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王璋瑜;;蛋白設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室公司買下融合蛋白技術(shù)實(shí)用權(quán)[J];生物技術(shù)通報(bào);1990年10期

2 張毅,屈賢銘,楊勝利;融合蛋白基因工程應(yīng)用及研究[J];生物工程進(jìn)展;2000年03期

3 楊林,李國(guó)清,黃葆英,王全忠,龍綮新,王s閼，

本文編號(hào)：865076