本文關鍵詞：ELP融合犬β干擾素的表達、純化、抗病毒活性及體外半衰期研究

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【摘要】：盡管犬疫苗接種較為普遍,但由于疫苗質(zhì)量、使用方法和病毒變異等原因,犬細小病毒病、犬瘟熱、犬病毒性肝炎等傳染病流行仍較普遍。Ⅰ型干擾素(interferon,IFN)是具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子,其中犬重組α干擾素(CaIFN-α)廣泛用于犬病毒病的治療,并取得良好的治療效果。但現(xiàn)有的犬重組α干擾素多為組氨酸標簽融合蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式表達,需要經(jīng)過變性、復性和親和層析法純化,不僅價格較高,而且體內(nèi)半衰期較短。延長干擾素體內(nèi)半衰期的主要策略有聚乙二醇化和與血清白蛋白等進行融合表達,前者的反應條件和產(chǎn)品質(zhì)量較難控制,后者仍需親和層析等方法純化。類彈性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)是一類根據(jù)體內(nèi)彈性蛋白重復序列合成的五肽聚合物,具有溫度敏感的可逆相變特性,可用離心等簡單方法分離純化,因此ELP已被用作重組蛋白的純化標簽。另外,ELP還被用作體內(nèi)藥物傳送載體,以起到緩釋和延長半衰期作用。犬β干擾素(CalFN-β)與CalFN-α具有類似的抗病毒作用,但目前尚無基因工程產(chǎn)品上市。本研究用PCR擴增CaIFN-β成熟肽編碼序列,分別將其插入原核表達載體pET-30a和ELP融合表達載體pET-ELP,獲得重組載體pET-CaIFNβ和pCaIFNβ-ELP。分別將重組載體轉化BL21(DE3)大腸桿菌,在不同溫度下用IPTG誘導融合蛋白表達。SDS-PAGE分析結果顯示：在37℃條件下His-CaIFNβ和CalFNβ-ELP融合蛋白均獲得正確表達,但表達產(chǎn)物均為不可溶性包涵體。為了獲得可溶性表達產(chǎn)物,對兩種融合蛋白的誘導表達溫度進行了優(yōu)化,SDS-PAGE分析結果顯示：CaIFNp-ELP融合蛋白在低于30℃條件下主要以可溶性蛋白表達,而His-CaIFNβ融合蛋白即使在20℃條件下仍以不溶性包涵體表達,表明ELP可增加CaIFN-β的可溶性。在次基礎上對IPTG誘導CaIFNβ-ELP融合蛋白表達的濃度和時間進行了優(yōu)化,結果顯示：在20℃條件下,0.1～1.0 mM IPTG均能誘導CaIFNβ-ELP融合蛋白表達,其中0.2 mM IPTG誘導表達產(chǎn)物的量較多,但差異不顯著；在6-24h時間內(nèi),CaIFNβ-ELP融合蛋白表達量隨誘導時間的延長呈上升趨勢,誘導18h的表達量最高。這些研究結果為兩種融合蛋白的純化及抗病毒活性研究打下基礎。分別在優(yōu)化條件下進行His-CaIFNβ和CaiFNp-ELP融合蛋白誘導表達。His-CaiFNβ融合蛋白經(jīng)過變性、復性后進行鎳親和柱層析純化,結果顯示：融合蛋白純度為85%,產(chǎn)量為50 mg/L細菌培養(yǎng)。CaIFNβ-ELP融合蛋白用相變循環(huán)(ITC)純化,并對相變溫度、氯化鈉濃度和離心力等參數(shù)進行了優(yōu)化,結果顯示：CaIFNβ-ELP融合蛋白的相變溫度為28℃,氯化鈉濃度為20 mol/L,適宜離心力為12000 g。用優(yōu)化ITC條件進行CaIFNβ-ELP融合蛋白純化,純化產(chǎn)物用4 mol/L尿素溶解,透析后進行SDS-PAGE分析,結果顯示：CaIFNβ-ELP融合蛋白的純度達96%,產(chǎn)量可達220mg/L。以MDCK細胞/水泡性口炎病毒系統(tǒng)進行干擾素活性檢測,結果顯示：His-CaIFNβ融合蛋白的抗病毒效價為104U/mg,CaIFNβ-ELP融合蛋白的抗病毒效價為105 U/mg。血清穩(wěn)定性檢測結果顯示,CaIFNβ-ELP融合蛋白的體外半衰期大于24h,顯著高于His-CaIFNβ融合蛋白的12h。這些研究結果表明,ELP是有效的C aIFN-β表達和純化標簽,純化的CaIFNβ-ELP融合蛋白具有較高的抗病毒活性和較長的體外半衰期,有望用于犬病毒病的臨床治療。
【關鍵詞】：犬重組β干擾素 類彈性蛋白多肽 融合表達 分離純化 抗病毒活性
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;S858.292
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 符號說明8-9
• 綜述一：犬干擾素研究進展9-15
• 1 干擾素概述9-10
• 2 犬干擾素的作用及應用10-12
• 3 干擾素的制備12-13
• 4 長效干擾素研究13-14
• 5 結語14-15
• 綜述二：類彈性蛋白多肽及其在重組蛋白純化中的應用15-23
• 1. 綜述15-17
• 2. 在重組蛋白純化中的應用17-23
• 研究內(nèi)容一：不同標簽融合犬β干擾素的表達及條件優(yōu)化23-37
• 1. 材料與方法23-32
• 1.1 主要試劑23
• 1.2 載體與菌株23-24
• 1.3 溶液與培養(yǎng)基24-25
• 1.4 實驗設備25
• 1.5 目的基因PCR擴增25-26
• 1.6 PCR產(chǎn)物純化26
• 1.7 目的片段與T載體連接26
• 1.8 感受態(tài)細胞制備26-27
• 1.9 連接產(chǎn)物轉化27
• 1.10 重組子鑒定27-28
• 1.11 表達載體構建28-29
• 1.12 融合蛋白表達29-32
• 2. 結果32-35
• 2.1 目的基因PCR擴增32
• 2.2 表達載體鑒定32-33
• 2.3 融合干擾素表達分析33
• 2.4 誘導表達溫度優(yōu)化33-34
• 2.5 可溶性蛋白表達分析34-35
• 2.6 IPTG濃度和誘導時間優(yōu)化35
• 3. 討論35-37
• 研究內(nèi)容二：融合犬β干擾素的分離純化及抗病毒活性和體外半衰期比較37-48
• 1. 材料與方法37-42
• 1.1 試劑與耗材37
• 1.2 主要溶液37-38
• 1.3 主要儀器設備38
• 1.4 His-CaIFN β純化38
• 1.5 CaIFN β-ELP純化38-40
• 1.6 干擾素活性檢測40-42
• 1.7 干擾素血漿穩(wěn)定性檢測42
• 2. 結果42-46
• 2.1 His-CaIFN β純化42-43
• 2.2 CaIFNβ-ELP純化43-45
• 2.3 VSV滴度測定45
• 2.4 融合干擾素活性測定45
• 2.5 間接免疫熒光45-46
• 2.6 干擾素血漿穩(wěn)定性46
• 3. 討論46-48
• 參考文獻48-54
• 致謝54-55

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王璋瑜;;蛋白設計實驗室公司買下融合蛋白技術實用權[J];生物技術通報;1990年10期

2 張毅,屈賢銘,楊勝利;融合蛋白基因工程應用及研究[J];生物工程進展;2000年03期

3 楊林,李國清,黃葆英,王全忠,龍綮新,王s閼，

本文編號：865076