發(fā)布時(shí)間：2017-09-15 21:35

  本文關(guān)鍵詞：羊痘病毒代謝組學(xué)研究及表達(dá)口蹄疫病毒抗原表位的活載體疫苗構(gòu)建

  更多相關(guān)文章： 口蹄疫病毒 山羊痘病毒 B細(xì)胞抗原表位 同源重組 代謝組學(xué)

【摘要】：羊痘(Capripox,CP),是由羊痘病毒屬(Capripoxvirus)的綿羊痘病毒(sheeppox virus, SPPV)或山羊痘病毒(goatpox virus, GTPV)引起的羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病,是惟一在細(xì)胞漿內(nèi)復(fù)制的有囊膜的雙股DNA病毒。羊痘給我國(guó)家畜生產(chǎn)和家畜產(chǎn)品帶來(lái)嚴(yán)重的危害,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,被OIE列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病。口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的牛、羊和豬等重要經(jīng)濟(jì)畜種發(fā)病的重大動(dòng)物疫病。FMDV不僅宿主廣泛,傳播速度快,而且血清型多,分別為O、A、C、Asial、 SAT1、SAT2和SAT3等七個(gè)血清型。本研究經(jīng)過(guò)篩選和鑒定O型口蹄疫病毒的B細(xì)胞抗原表位,根據(jù)同源重組的原理,構(gòu)建含有外源基因即抗原表位的表達(dá)盒,插入到含有胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)基因左右同源臂的載體中,構(gòu)建病毒轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染到接種山羊痘病毒疫苗毒株的LT細(xì)胞中進(jìn)行同源重組,篩選重組病毒。(1)口蹄疫O型Mya98毒株B細(xì)胞抗原表位的篩選與鑒定克隆了O型口蹄疫M(jìn)ya98毒株的P1基因,運(yùn)用：DNAstar軟件對(duì)該病毒P1包含的4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)完整的氨基酸序列進(jìn)行分析。分別按照Kyte-Doolittle方案、Karplus-Schulz方案、Jameson-Wolf方案和Emini方案分析口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白P1的親水性(Hydrophilicity)、可塑性(Flexibility)、抗原指數(shù)(Antigenic index)、和表面可及性(Surface probability),并綜合以上指數(shù)最終得出P1結(jié)構(gòu)蛋白上B細(xì)胞潛在的抗原表位是具有親水性強(qiáng),可塑性大的p轉(zhuǎn)角或是無(wú)規(guī)則卷曲的部位,用Western blot和ELISA鑒定表位。(2)表達(dá)O型口蹄疫病毒抗原表位重組羊痘病毒的構(gòu)建根據(jù)同源重組的原理,將啟動(dòng)子(P7.5/11)、報(bào)告基因(EGFP和GPT)、目的基因抗原表位(Epitope)、調(diào)控元件和終止子分別克隆連接到T載體,片段酶切后再用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,構(gòu)建基因表達(dá)盒;選擇TK基因?yàn)橥庠椿虻陌邢蛭稽c(diǎn),提取山羊痘病毒弱毒疫苗株(AV41)基因,克隆得到含TK基因ORF的兩側(cè)的同源臂,連接到T載體上；把含有各反應(yīng)元件的表達(dá)盒插入到PGEM-TK中,構(gòu)建出P7.5-EGFP-P11-GPT-Epitope的轉(zhuǎn)移載體；轉(zhuǎn)染到細(xì)胞里。(3)重組病毒的初步篩選對(duì)感染山羊痘病毒前、后的細(xì)胞進(jìn)行代謝組學(xué)分析,為后續(xù)的重組病毒感染羊睪丸細(xì)胞的代謝組學(xué)分析、建立重組病毒的篩選方法提供依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：口蹄疫病毒 山羊痘病毒 B細(xì)胞抗原表位 同源重組 代謝組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 英文縮略表9-12
• 第一章 研究背景12-24
• 1.1 羊痘的流行病學(xué)12-13
• 1.1.1 羊痘病毒概況12
• 1.1.2 羊痘病毒的基因組12-13
• 1.1.3 羊痘病毒的流行特征13
• 1.2 口蹄疫病毒的研究進(jìn)展13-14
• 1.2.1 口蹄疫病毒基因組的基本結(jié)構(gòu)13
• 1.2.2 口蹄疫病毒主要的抗原位點(diǎn)13-14
• 1.3 同源重組介導(dǎo)的重組病毒研究進(jìn)展14-21
• 1.3.1 表達(dá)盒的構(gòu)建策略研究概述14-15
• 1.3.2 外源基因的靶向位點(diǎn)研究方法15-18
• 1.3.3 病毒同源重組的研究方法18
• 1.3.4 重組病毒的篩選研究進(jìn)展18-19
• 1.3.5 疫苗研究中應(yīng)用的活載體病毒19-21
• 1.4 代謝組學(xué)21-22
• 1.4.1 代謝組學(xué)的概念及發(fā)展22
• 1.4.2 代謝組學(xué)的應(yīng)用研究22
• 1.5 本研究的目的和意義22-24
• 第二章 O型口蹄疫病毒抗原表位的篩選和鑒定24-30
• 2.1 試驗(yàn)材料24-25
• 2.1.1 病毒樣品24
• 2.1.2 試劑及配制24-25
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備25
• 2.2 試驗(yàn)方法25-27
• 2.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成25
• 2.2.2 FMDV基因組RNA的提取25
• 2.2.3 FMDV的RNA反轉(zhuǎn)錄25-26
• 2.2.4 多克隆抗體中IgG的純化26
• 2.2.5 ELISA鑒定表位肽26
• 2.2.6 Western blot鑒定抗原表位26-27
• 2.3 結(jié)果27-28
• 2.3.1 抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果27
• 2.3.2 ELISA鑒定表位肽結(jié)果27-28
• 2.3.3 Western blot鑒定抗原表位結(jié)果28
• 2.4 討論28-30
• 第三章 表達(dá)FMDV抗原表位重組羊痘病毒的構(gòu)建及篩選30-36
• 3.1 試驗(yàn)材料30-31
• 3.1.1 病毒與細(xì)胞30
• 3.1.2 主要試劑及配制30-31
• 3.1.3 儀器與設(shè)備31
• 3.2 試驗(yàn)方法31-33
• 3.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇31
• 3.2.2 細(xì)胞接毒、傳代和收毒31
• 3.2.3 GTPV基因組DNA的提取31-32
• 3.2.4 GTPV復(fù)制非必需區(qū)的篩選32
• 3.2.5 構(gòu)建病毒轉(zhuǎn)移載體32
• 3.2.6 病毒蝕斑實(shí)驗(yàn)32-33
• 3.2.7 重組病毒的制備、純化及鑒定33
• 3.3 結(jié)果33-35
• 3.3.1 病毒蝕斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-34
• 3.3.2 熒光顯微鏡下重組病毒觀(guān)察結(jié)果34
• 3.3.3 重組病毒PCR鑒定結(jié)果34-35
• 3.4 討論35-36
• 第四章 細(xì)胞代謝組學(xué)分析36-41
• 4.1 試驗(yàn)材料36
• 4.1.1 病毒與細(xì)胞36
• 4.1.2 儀器與試劑36
• 4.2 試驗(yàn)方法36-37
• 4.2.1 代謝物萃取36
• 4.2.2 代謝物衍生化36-37
• 4.3 結(jié)果37-39
• 4.3.1 代謝組學(xué)分析37-39
• 4.4 討論39-41
• 第五章 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-47
• 附錄47-50
• 致謝50

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張華;澳大利亞嚴(yán)防口蹄疫的入侵[J];全球科技經(jīng)濟(jì)w，

本文編號(hào)：859028