本文關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌多位點序列分型及其密度感應(yīng)信號分子初步鑒定

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【摘要】：副豬嗜血桿菌(HPS)是豬格拉澤氏病的病原菌,可以引起多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎,給豬群造成較高的發(fā)病率與死亡率。雖然目前血清分型鑒定了副豬嗜血桿菌的15個血清型,但仍然存在大量的不可分型菌株,這極大地限制了流行病學(xué)及種群結(jié)構(gòu)分析,有必要通過MLST等基因分型方法對我國副豬嗜血桿菌進(jìn)行分類。細(xì)菌生物被膜是造成副豬嗜血桿菌定植及耐藥的主要原因,密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控生物被膜的形成,可能與副豬嗜血桿菌的致病機(jī)制相關(guān),而目前尚未有對于副豬嗜血桿菌密度感應(yīng)系統(tǒng)的報道,故對副豬嗜血桿菌密度感應(yīng)系統(tǒng)信號分子的研究有助于揭示該菌的致病機(jī)制。本研究對50株副豬嗜血桿菌田間分離株和15株參考株進(jìn)行了MLST分型,共發(fā)現(xiàn)了26個新的等位基因序列和29個新的ST型,這極大地豐富了副豬嗜血桿菌MLST數(shù)據(jù)庫。BURST分析表明副豬嗜血桿菌缺乏穩(wěn)定的種群結(jié)構(gòu),具有較高異質(zhì)性;ST型與地理位置之間也不存在關(guān)聯(lián)。UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹將所有的菌株分為兩大組,A組和B組,存在于A組的菌株所屬的血清型基本為無毒或弱毒,B組趨向于強(qiáng)毒菌株。利用密度感應(yīng)系統(tǒng)Ⅰ型信號分子報告菌CV026和KYC55,對生物被膜形成能力較強(qiáng)的副豬嗜血桿菌田間分離株H19是否產(chǎn)生AHL類信號分子進(jìn)行了定性檢測,進(jìn)而利用HPLC-MS-MS對副豬嗜血桿菌H19培養(yǎng)上清中存在的Ⅰ型信號分子進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌所合成的Ⅰ型信號分子共有兩種,其相對分子質(zhì)量與C10-HSL和C12-HSL相同,但結(jié)構(gòu)不同,由于確定其結(jié)構(gòu)需要進(jìn)行大量提取純化,而H19產(chǎn)生的信號分子量極少,因此未能對其結(jié)構(gòu)作進(jìn)一步鑒定。兒茶酸具有抑制密度感應(yīng)機(jī)制的作用,兒茶酸對副豬嗜血桿菌生物被膜形成的試驗結(jié)果表明,兒茶酸使副豬嗜血桿菌H19生物被膜形成能力降低25.4%。利用自殺質(zhì)粒pK18mobsacB通過同源重組方法,成功構(gòu)建了副豬嗜血桿菌H19的ΔRbsB基因缺失突變株及其回復(fù)株,并進(jìn)行了生物被膜形成能力檢測,發(fā)現(xiàn)ΔRbsB基因缺失突變株生物被膜形成能力降低,而回復(fù)株生物被膜形成能力有所提升,初步確定RbsB基因與生物被膜形成有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：副豬嗜血桿菌 生物被膜 多位點序列分型 密度感應(yīng)系統(tǒng) 基因缺失
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 英文縮略表10-11
• 第一章 引言11-19
• 1.1 副豬嗜血桿菌研究進(jìn)展11-13
• 1.1.1 副豬嗜血桿菌概述及生理生化特征11
• 1.1.2 副豬嗜血桿菌流行病學(xué)及分型11-13
• 1.1.3 突變株構(gòu)建方法13
• 1.2 細(xì)菌生物被膜研究進(jìn)展13-15
• 1.2.1 細(xì)菌生物被膜的特點14
• 1.2.2 細(xì)菌生物被膜的形成過程14
• 1.2.3 細(xì)菌生物被膜的耐藥機(jī)制14
• 1.2.4 細(xì)菌生物被膜的致病機(jī)制14-15
• 1.3 密度感應(yīng)系統(tǒng)研究進(jìn)展15-18
• 1.3.1 細(xì)菌QS的種類及其信號分子15-17
• 1.3.2 QS系統(tǒng)信號分子的檢測17
• 1.3.3 QS的應(yīng)用17-18
• 1.4 本實驗的研究目的及意義18-19
• 第二章 副豬嗜血桿菌的分離鑒定及其MLST分型19-32
• 2.1 實驗材料19
• 2.1.1 實驗菌株及培養(yǎng)基19
• 2.1.2 主要試劑19
• 2.1.3 培養(yǎng)基的配制19
• 2.2 實驗方法19-25
• 2.2.1 細(xì)菌菌株的培養(yǎng)19
• 2.2.2 革蘭氏染色鏡檢19
• 2.2.3 細(xì)菌基因組的提取19-23
• 2.2.4 16S rRNA PCR擴(kuò)增23
• 2.2.5 MLST分型23-25
• 2.3 實驗結(jié)果25-30
• 2.3.1 革蘭氏染色鏡檢25
• 2.3.2 16S rRNA PCR擴(kuò)增25-26
• 2.3.3 MLST 7 個管家基因PCR擴(kuò)增26
• 2.3.4 等位基因序列分析26-27
• 2.3.5 ST型分析27
• 2.3.6 多位點序列分型與血清型之間的關(guān)系27
• 2.3.7 BURST分析27-28
• 2.3.8 UPGMA聚類分析28-30
• 2.4 討論30-32
• 第三章 副豬嗜血桿菌密度感應(yīng)系統(tǒng)信號分子的檢測與初步鑒定32-43
• 3.1 實驗材料32
• 3.1.1 實驗菌株32
• 3.1.2 培養(yǎng)基及液體試劑的制備32
• 3.1.3 主要試劑32
• 3.2 實驗方法32-35
• 3.2.1 細(xì)菌菌株的培養(yǎng)32
• 3.2.2 H19（未加血清）生長曲線的測定32-33
• 3.2.3 H19生物被膜形成能力及周期檢測33-34
• 3.2.4 密度感應(yīng)信號分子的檢測與鑒定34-35
• 3.2.5 兒茶酸對生物被膜形成的影響35
• 3.3 實驗結(jié)果35-42
• 3.3.1 H19（未加血清）生長曲線35-36
• 3.3.2 H19細(xì)菌生物被膜檢測結(jié)果36-37
• 3.3.3 密度感應(yīng)信號分子的檢測與初步鑒定37-41
• 3.3.4 兒茶酸對生物被膜形成的影響41-42
• 3.4 討論42-43
• 第四章 副豬嗜血桿菌RBSB基因缺失突變株的構(gòu)建43-55
• 4.1 實驗材料43
• 4.1.1 實驗菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基43
• 4.1.2 主要試劑43
• 4.2 實驗方法43-50
• 4.2.1 菌株的培養(yǎng)條件43
• 4.2.2 細(xì)菌基因組的提取43
• 4.2.3 突變株的構(gòu)建43-48
• 4.2.4 回補(bǔ)株的構(gòu)建48-49
• 4.2.5 生物被膜形成能力檢測49-50
• 4.3 實驗結(jié)果50-53
• 4.3.1 pWLYR-1 質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定50
• 4.3.2 pWLYR-2 質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定50-51
• 4.3.3 ΔRbs B基因缺失株的鑒定51-52
• 4.3.4 pWLYR-3 質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定52
• 4.3.5 ΔRbs B基因缺失突變回復(fù)株的鑒定52-53
• 4.3.6 生物被膜形成能力檢測結(jié)果53
• 4.4 討論53-55
• 第五章 全文結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-62
• 致謝62-63
• 作者簡歷63

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本文編號：842536