本文關(guān)鍵詞：基于ELP-Hsp90α融合蛋白IBDV濃縮和純化方法的建立與應(yīng)用

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【摘要】：傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是雞的一種高度接觸性傳染病,主要侵害3-6周齡雞的法氏囊,導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制、免疫失敗和對其他病原的易感性增強(qiáng),給世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)是雙RNA病毒科成員,病毒顆粒無囊膜,對熱、pH3-9和有機(jī)溶劑穩(wěn)定,因此可用氯仿和聚乙二醇沉淀和濃縮,用蔗糖或氯化銫密度梯度離心和凝膠過濾等方法純化,但這些方法具有費(fèi)時、費(fèi)錢和回收率低等缺點(diǎn)。病毒受體結(jié)合捕捉(Virus receptor-binding capture)技術(shù)利用病毒受體偶聯(lián)的磁珠等固相載體從組織和環(huán)境樣品中捕捉病毒,具有簡單、快速和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),與PCR等技術(shù)相結(jié)合已成功用于病毒的環(huán)境監(jiān)測。用類彈性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)取代固相載體,本課題組建立了更為簡單、經(jīng)濟(jì)的腺病毒濃縮與純化方法。熱應(yīng)激蛋白90a (Heat shock protein 90a, Hsp90a)是IBDV受體復(fù)合物成分,本課題組的前期研究結(jié)果顯示Hsp90a C端444個氨基酸區(qū)域(C444)能與IBDV結(jié)合,為建立Hsp90a結(jié)合IBDV捕捉方法奠定了基礎(chǔ)。本研究將C444區(qū)分為3段與ELP進(jìn)行融合表達(dá),在進(jìn)一步明確IBDV結(jié)合區(qū)的基礎(chǔ)上,用其ELP融合蛋白建立了IBDV快速濃縮與純化方法。將Hsp90a的C444區(qū)分為283-449、356-606和597-728位氨基酸3個部分重疊的片段,將PCR擴(kuò)增的編碼序列分別與ELP序列融合,構(gòu)建原核表達(dá)載體pELP-283-449、pELP-356-606和pELP-597-728。將重組載體轉(zhuǎn)化BLR大腸桿菌,用IPTG在20℃誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),利用ELP的溫度敏感可逆相變循環(huán)(ITC)獲得了純度較高的融合蛋白ELP-283-449、 ELP-356-606和ELP-597-728。分別將純化的融合蛋白與IBDV進(jìn)行共孵育,利用ITC沉淀融合蛋白-病毒復(fù)合物,經(jīng)RT-PCR檢測證明,ELP-283-449融合蛋白能與IBDV結(jié)合。將不同濃度的ELP-283-449融合蛋白與IBDV混合,在不同pH和溫度下孵育不同時間,用ITC沉淀結(jié)合的IBDV,病毒滴定結(jié)果顯示ELP-283-449結(jié)合IBDV的最佳條件為160μg/mL蛋白、16℃、pH7.0和1h。將沉淀的融合蛋白-IBDV復(fù)合物在不同pH和溫度下洗脫不同時間,病毒滴定結(jié)果顯示洗脫IBDV的最佳條件為22℃、pH9.0和30min。在優(yōu)化條件下用ELP-283-449融合蛋白分別從IBDV感染細(xì)胞培養(yǎng)上清和裂解細(xì)胞中濃縮和純化病毒,病毒滴定結(jié)果顯示IBDV的回收率分別為75.4%和71.7%。在優(yōu)化條件下進(jìn)行IBDV洗脫,結(jié)果顯示洗脫病毒的回收率分別為39.3%和42.5%。將不同濃度IBDV接種自來水和PBS,然后用ELP-283-449融合蛋白進(jìn)行病毒濃縮和回收,結(jié)果顯示ELP-283-449融合蛋白捕獲PBS和自來水中IBDV的效率分別為73%和68%。這些研究結(jié)果表明：熱應(yīng)激蛋白90a的IBDV結(jié)合區(qū)位于其283～449位氨基酸區(qū)域,ELP-283-449融合蛋白可用于組織和環(huán)境樣品中IBDV的濃縮與純化。
【關(guān)鍵詞】：傳染性法氏囊病病毒 熱應(yīng)激蛋白90α 類彈性蛋白多肽 融合表達(dá) 病毒濃縮與純化
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 中英文簡寫8-9
• 文獻(xiàn)綜述9-19
• 一、傳染性法氏囊病毒研究進(jìn)展9-13
• 1. 概述9
• 2. 病毒蛋白及功能9-10
• 3. 致病機(jī)理10-11
• 4. 免疫預(yù)防11-13
• 二、IBDV受體的研究進(jìn)展13-19
• 1. 病毒受體概述13-14
• 2. 病毒受體的研究方法14-16
• 3. IBDV受體的研究進(jìn)展16-17
• 4. 病毒受體的應(yīng)用17-19
• 研究內(nèi)容一：Hsp90α片段與ELP的融合表達(dá)及IBDV結(jié)合區(qū)的確定19-35
• 1. 材料和方法19-30
• 1.1 材料19-22
• 1.2 方法22-30
• 1.2.1 目的片段的克隆與鑒定22-25
• 1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建25-27
• 1.2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與分析27-29
• 1.2.4 重組蛋白的純化29
• 1.2.5 IBDV結(jié)合區(qū)的確定29-30
• 2. 結(jié)果30-34
• 2.1 表達(dá)構(gòu)建與鑒定30-31
• 2.2 融合蛋白的表達(dá)31-32
• 2.3 融合蛋白的純化32-33
• 2.4 融合蛋白IBDV結(jié)合區(qū)鑒定33-34
• 3. 討論34-35
• 研究內(nèi)容二：IBDV快速濃縮與純化方法的建立與應(yīng)用35-46
• 1. 材料與方法35-39
• 1.1 材料35-36
• 1.2 方法36-38
• 1.2.1 IBDV滴定36-37
• 1.2.2 融合蛋白結(jié)合IBDV的條件優(yōu)化37-38
• 1.2.3 IBDV洗脫條件的優(yōu)化38
• 1.3 IBDV快速濃縮與純化方法的應(yīng)用38-39
• 2. 結(jié)果39-43
• 2.239-43
• 2.2.1 IBDV的滴度測定39
• 2.2.2 融合蛋白結(jié)合IBDV的條件優(yōu)化39-41
• 2.2.3 IBDV洗脫條件的優(yōu)化41-43
• 2.3 IBDV快速濃縮與純化方法的應(yīng)用43
• 3. 討論43-46
• 全文總結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-55
• 致謝55-56

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王璋瑜;;蛋白設(shè)計實(shí)驗(yàn)室公司買下融合蛋白技術(shù)實(shí)用權(quán)[J];生物技術(shù)通報;1990年10期

2 張毅,屈賢銘,楊勝利;融合蛋白基因工程應(yīng)用及研究[J];生物工程進(jìn)展;2000年03期

3 楊林,李國清,黃葆英,王全忠,龍綮新,王s閼，

本文編號：829898