本文關(guān)鍵詞：甲硫氨酸代謝通路對禽致病性大腸桿菌調(diào)控機制的研究

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【摘要】：禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的一種禽類局部或全身性傳染病,其廣泛的耐藥性和復雜的血清型,一直制約對該病的防控,并對全球的養(yǎng)禽業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。存在于革蘭氏陰性和陽性細菌中的LuxS/AI-2型密度感應系統(tǒng),可產(chǎn)生通用自誘導信號分子AI-2 (Autoinducer,AI-2)。AI-2可與細菌受體結(jié)合,進一步誘導胞內(nèi)相關(guān)基因的表達,最終調(diào)節(jié)自身的生理特性。AI-2的產(chǎn)生涉及微生物甲硫氨酸代謝通路(Activated methionine cycle, AMC),細菌可采用pfs/luxS和sa hH兩種AMC代謝通路,而不同的代謝通路對APEC的調(diào)控機制以及應用甲硫氨酸代謝通路防治APEC的方法仍有待研究。本研究通過在APEC中構(gòu)建不同甲硫氨酸代謝通路,探討APEC在采用不同的甲硫氨酸代謝通路下對其致病性的影響,為研究APEC的致病機理提供基礎(chǔ),其中阻斷或者改變APEC甲硫氨酸代謝通路的方法對APEC的診療及防控技術(shù)具有重要的應用價值。一.甲硫氨酸代謝通路中IuxS、pfs和sahH基因的克隆、表達以及體外活性驗證為了驗證在禽致病性大腸桿菌DE17株中構(gòu)建甲硫氨酸sahH代謝通路的可行性,本研究構(gòu)建了原核表達載體pET28a-luxS, pET28a-pfs 以及ET28a-sahH;可溶性分析結(jié)果表明,重組蛋白Pfs, LuxS和SahH蛋白在大腸桿菌中均為可溶性表達。體外活性實驗分析結(jié)果表明,重組蛋白LuxS和Pfs同時與SAH作用后可產(chǎn)生400μmol/L的同型半胱氨酸(Homocysteine, HCY),而在相同條件下SahH蛋白只能催化SAH產(chǎn)生47.3 μmol/L的HCY。本研究成功獲得了具有生物催化活性的Pfs、LuxS和SahH蛋白,驗證了在DE17內(nèi)構(gòu)建sahH循環(huán)途徑的可行性,為后續(xù)研究AMC通路對APEC致病性的影響奠定基礎(chǔ)。二.APEC中不同甲硫氨酸代謝通路的構(gòu)建為了在APEC中構(gòu)建不同的甲硫氨酸代謝通路,本研究成功構(gòu)建阻斷pfs/luxS代謝通路的DE17Δpfs。由于APEC不具備sahH代謝通路,本研究構(gòu)建了銅綠假單胞菌sahH基因的回復性載體pSTV-sahH,并分別轉(zhuǎn)化至DE17和DE17Δpfs中,分別得到存在pfs/luxS和sahl倆種AMC通路的互補株sahH-DE17和只存在sahH甲硫氨酸代謝通路的互補株sahH-DE17Δpfs。Real-time PCR檢測結(jié)果表明,sahH基因在sahH-DE17和sahH-DE17Δpfs中成功轉(zhuǎn)錄。AI-2活性檢測實驗證實,DE17Δpfsfs和sahH-DE17Δpfs的生長過程中不產(chǎn)生AI-2。與野生株DE17相比,sahH-DE 17的AI-2的生成受到明顯抑制,至第6小時最為顯著。本研究成功在APEC野生株DE17和缺失株DE17△pfs中,構(gòu)建了甲硫氨酸sahH代謝通路,為進一步開展利用阻斷或者改變甲硫氨酸代謝通路調(diào)節(jié)APEC致病性的應用型研究提供基礎(chǔ)。三.不同甲硫氨酸代謝通路對APEC致病性的影響為了研究不同甲硫氨酸代謝通路對APEC致病性的影響,本研究開展了如下生物學特性研究：1)生長曲線測定。sahH-DE 17的生長快于DE17,而DE17Δpfs和sahH-DE17Δpfs的生長特性無顯著差異,但均比DE17顯著緩慢。2)LD50測定。與野生株DE17 (LD50為1.24×103 CF U)相比, DE17Δpfs (LD50為8.06×105CFU)毒力降低650倍,sahH-DE17Δpfs (LD50為6.49×104 CFU)毒力降低52.3倍,而sahH-DE17 (LD50)為4.22×103 CFU)毒力無顯著變化。3)體內(nèi)分布測定。與野生株DE17(血液：2.1×106CFU/mL；肝臟：1.7×107 CFU/g;脾臟：2.3×108 CFU/g;腎臟：4. 1×108 CFU/g)相比,DE17Δpfs (血液：1.6×102 CFU/mL肝臟：7.5×102 CFU/g脾臟：1.1×104 CFU/g;腎臟：1.4×104 CFU/g)的載菌量顯著降低(P0.001), sahH-DE17Δpfs (血液：2.7×104CFU/mL肝臟：2.8×10s CFU/g;脾臟：8.9×104 CFU/g;腎臟：9.6×105 CFU/g)的載菌量顯著降低(P0.001)；而sahH-DE17僅在肝臟的載菌量比DE17顯著降低(肝臟,P0.001),在其他臟器或血液內(nèi)無明顯差異。4)黏附與侵襲實驗。與野生株DE17(黏附：1.1×107CFU/孔；侵襲：1.4×104 CFU/孔)相比,DE17Δpfs (黏附：6.9×106 CFU/孔；侵襲：7.6x103 CFU/孔)的黏附與侵襲能力顯著降低(P0.01),而sahH-DE17(黏附：9.8×106 CFU/孔；侵襲：8.4×10a CFU/孔)黏附無顯著差異,侵襲能力顯著減弱(侵襲,P0.01)。上述結(jié)果表明,在APEC中阻(?)rpfs/luxS代謝通路可以導致其致病性的降低,而構(gòu)建sahH甲硫氨酸代謝通路僅能部分恢復其受損功能。本研究證實了APEC的pfs/luxS甲硫氨酸代謝通路對其致病性具有重要的調(diào)控作用。通過阻斷或者改變APEC甲硫氨酸代謝通路來降低致病性的方法,為基于甲硫氨酸代謝通路開展APEC的致病機制及防控技術(shù)研究提供了重要的應用基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：禽致病性大腸桿菌 甲硫氨酸代謝通路 LuxS/AI-2型密度感應系統(tǒng) sahH基因 pfs基因
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-9
• 符號說明9-11
• 第一章 文獻綜述11-18
• 1 禽致病性大腸桿菌的研究進展11-12
• 1.1 禽致病性大腸桿菌的流行病學11
• 1.2 禽致病性大腸桿菌的致病因子11-12
• 1.3 禽致病性大腸桿菌的防控措施12
• 2 細菌密度感應系統(tǒng)的研究進展12-18
• 2.1 密度感應系統(tǒng)與細菌感染13
• 2.2 LuxS/AI-2型密度感應系統(tǒng)13-14
• 2.3 AI-2的合成途徑和結(jié)構(gòu)特征14-15
• 2.4 甲硫氨酸代謝通路15-18
• 第二章 禽致病性大腸桿菌中不同甲硫氨酸代謝通路的體外活性驗證18-29
• 1 材料18-20
• 1.1 菌株及質(zhì)粒18
• 1.2 主要試劑18-19
• 1.3 培養(yǎng)基19-20
• 1.4 主要儀器20
• 2 方法20-23
• 2.1 PCR引物設計和產(chǎn)物回收20-21
• 2.2 pET28a-luxS,pET28a-pfs以及pET28a-sahH原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建21-22
• 2.3 重組蛋白LuxS、Pfs和SahH誘導表達及SDS-PAGE分析22
• 2.4 重組蛋白LuxS、Pfs和SahH的純化22
• 2.5 重組蛋白LuxS、Pfs與SahH的體外催化活性驗證22-23
• 3 結(jié)果23-28
• 3.1 原核表達質(zhì)粒pET28a-luxS,pET28a-pfs以及pET28a-sahH的構(gòu)建23-25
• 3.2 重組菌BL21(pET28a-luxS),BL21(pET28a-pfs)和BL21(pET28a-sahH)的鑒定和測序25-26
• 3.3 重組菌BL21(pET28a-luxS),BL21(pET28a-pfs)和BL21(pET28a-sahH)誘導、表達和可溶性分析26-27
• 3.4 HCY測定標準曲線27
• 3.5 LuxS/Pfs和SahH的酶活測定結(jié)果27-28
• 4 討論28-29
• 第三章 禽致病性大腸桿菌不同甲硫氨酸循環(huán)通路的構(gòu)建29-43
• 1 材料29-30
• 1.1 主要菌株29
• 1.2 主要試劑29-30
• 1.3 培養(yǎng)基30
• 1.4 主要儀器30
• 2 方法30-37
• 2.1 禽致病性大腸桿菌DE17△pfs基因缺失株的構(gòu)建30-33
• 2.2 APEC不同甲硫氨酸循環(huán)通路的構(gòu)建33-36
• 2.3 AI-2的活性檢測36-37
• 3 結(jié)果37-42
• 3.1 pfs基因打靶片段的構(gòu)建37-38
• 3.2 pfs基因缺失鑒定38-39
• 3.3 回復載體pSTV28-sahH的構(gòu)建39-40
• 3.4 sahH基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果40-41
• 3.5 AI-2的活性檢測結(jié)果41-42
• 4 討論42-43
• 第四章 不同甲硫氨酸代謝通路通路對禽致病性大腸桿菌致病性的影響43-53
• 1 材料44-45
• 1.1 主要菌株及細胞44
• 1.2 實驗動物44
• 1.3 主要試劑和培養(yǎng)基44-45
• 1.4 主要儀器45
• 2 方法45-47
• 2.1 菌株的培養(yǎng)條件45
• 2.2 生長曲線測定45
• 2.3 半數(shù)致死量(LD_(50))測定45-46
• 2.4 體內(nèi)分布實驗46
• 2.5 黏附與侵襲實驗46-47
• 3 結(jié)果47-51
• 3.1 生長曲線測定結(jié)果47-48
• 3.2 半數(shù)致死量測定結(jié)果48-49
• 3.3 體內(nèi)分布結(jié)果49-50
• 3.4 黏附與侵襲結(jié)果50-51
• 4 討論51-53
• 全文總結(jié)53-54
• 參考文獻54-63
• 致謝63-64
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文64-65

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1 焦清局;楊仲南;黃繼風;;擬南芥代謝通路下基因調(diào)控網(wǎng)絡的構(gòu)建[J];科學通報;2009年23期

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1 徐達;甲硫氨酸代謝通路對禽致病性大腸桿菌調(diào)控機制的研究[D];揚州大學;2016年

2 王東;基于計算機的微生物代謝通路重構(gòu)與在線平臺建設[D];蘇州大學;2012年

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本文編號：822065