本文關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNA調(diào)控小鼠卵巢發(fā)育的初步研究

  更多相關(guān)文章： 卵巢 黃體 長鏈非編碼RNA 體內(nèi)過表達 轉(zhuǎn)基因

【摘要】：卵巢是雌性動物生殖系統(tǒng)中重要的器官之一,它的功能主要分為兩大方面,一是作為卵母細胞發(fā)育成熟的場所,分化出具有受精能力的卵母細胞;二是卵巢分泌的性腺激素調(diào)控卵泡發(fā)育和生殖周期等。卵巢活動的周期性由多種因素調(diào)節(jié),如促性腺激素、細胞因子及核酸分子。長鏈非編碼RNA(lncRNA)能在表觀遺傳調(diào)控,轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等層面上調(diào)控基因的表達水平,已報道有很多l(xiāng)ncRNA參與了生物個體的發(fā)育和疾病的發(fā)生,成為基因研究的重點領域。卵巢是雌性動物機體生理變化最活躍的器官之一,但目前l(fā)ncRNA參與調(diào)控卵巢發(fā)育的研究鮮有報道。為了研究lncRNA在卵巢生殖活動中的功能,本論文設計了四個連續(xù)實驗,具體的實驗設計、研究內(nèi)容和實驗結(jié)果如下。實驗一:探討卵巢中特異性表達的lncRNA。首先,分析實驗室的lncRNA基因庫,從中篩選出16個基因,通過實時熒光定量PCR(qPCR)檢測證實有9個lncRNA在小鼠多種組織中相對高表達,并發(fā)現(xiàn)lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274在卵巢組織中相對特異性高表達。實驗二:不同卵巢狀態(tài)下lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274基因的表達豐度。分別檢測了這3個基因在小鼠不同發(fā)育時期(5日齡、3周齡、5周齡、8周齡)和發(fā)情周期不同發(fā)情時期(發(fā)情間期、發(fā)情前期、發(fā)情期和發(fā)情后期)卵巢中的表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA147和lncRNA274在8周齡小鼠卵巢中的表達水平最高,在其它3個發(fā)育階段卵巢中的表達水平從高到低依次為5日齡卵巢,5周齡卵巢和3周齡卵巢;lncRNA647在5周齡和8周齡卵巢中的表達水平最高,在其它2個發(fā)育時期卵巢中的表達水平從高到低依次為5天齡卵巢和3周齡卵巢。在發(fā)情周期不同發(fā)情時期的卵巢中,3個lncRNA的表達水平均按照發(fā)情間期、發(fā)情前期,發(fā)情期和發(fā)情后期依次升高,其中在發(fā)情后期中的表達水平顯著高于其它三個發(fā)情時期。實驗三:研究這3個lncRNA基因在卵巢中特異表達后對卵巢功能的影響。構(gòu)建ZP3基因啟動子-目的lncRNA基因過表達質(zhì)粒載體;利用體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法,在8周齡雌鼠右側(cè)卵巢中分別注射lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274載體,左側(cè)卵巢注射ZP3骨架載體(不含目的基因)。轉(zhuǎn)染72小時后摘取兩側(cè)卵巢,分別提取卵巢組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,檢測目的基因和卵泡發(fā)育相關(guān)基因的表達水平,以及卵巢組織制作石蠟切片并HE染色,觀察并統(tǒng)計腔前卵泡、有腔卵泡和黃體的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),卵巢組織中過表達lncRNA274后,與對照組相比卵泡發(fā)育相關(guān)基因FSHR的表達水平升高了約7倍,LHR升高了約18倍,GDF-9升高了約11倍,BMP-15升高了約7.5倍,EGFR升高了約7.5倍;黃體的數(shù)量(13.3±4.9)與對照組(4.3±0.6)相比顯著增加,而腔前卵泡、有腔卵泡數(shù)量無顯著差異。過表達lncRNA147后,與對照組相比FSHR、GDF-9、BMP-15的表達水平無顯著差異,LHR升高了約4倍,EGFR升高了約5倍;腔前卵泡、有腔卵泡和黃體的數(shù)量與對照組相比無顯著差異。過表達lncRNA647后,FSHR、LHR、GDF-9,BMP-15和EGFR的表達水平與對照組相比均無顯著差異;腔前卵泡、有腔卵泡和黃體的數(shù)量與對照組相比無顯著差異。實驗四:進一步驗證lncRNA274對小鼠排卵的作用。構(gòu)建了lncRNA274轉(zhuǎn)基因小鼠。通過小鼠1細胞胚胎階段制作lncRNA274轉(zhuǎn)基因小鼠,分別獲得F0代和F1代的轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩野生型小鼠,并對其生育能力進行統(tǒng)計,結(jié)果發(fā)現(xiàn)10#-F0代轉(zhuǎn)基因雌鼠產(chǎn)仔數(shù)(10.5±0.6)較同窩野生型小鼠(7.75±1.7)有顯著差異,1#-F1代和10#-F1代轉(zhuǎn)基因雌鼠產(chǎn)仔數(shù)(11±1.4,10±1.4)較同窩野生型小鼠(7.5±0.7,6.5±0.7)也均有顯著差異。F0代和F1代轉(zhuǎn)基因小鼠子代與野生型小鼠子代的體重與體長無明顯差異。綜合上述實驗結(jié)果,發(fā)現(xiàn)3個在小鼠卵巢中相對特異性高表達的lncRNA(lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274),且它們在8周齡和發(fā)情后期的卵巢中表達水平相對較高。體內(nèi)轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)lncRNA274基因過表達后,卵泡發(fā)育相關(guān)基因的表達水平明顯升高,排卵數(shù)量明顯增加。構(gòu)建lncRNA274轉(zhuǎn)基因小鼠并進行表型分析,發(fā)現(xiàn)小鼠產(chǎn)仔數(shù)顯著增加。實驗結(jié)果表明,lncRNA可促進排卵。
【關(guān)鍵詞】：卵巢 黃體 長鏈非編碼RNA 體內(nèi)過表達 轉(zhuǎn)基因
【學位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S814.1
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 前言10-15
• 1.1 小鼠卵巢生殖生理10
• 1.2 卵泡的發(fā)育與調(diào)控10-12
• 1.2.1 卵泡發(fā)育10-11
• 1.2.2 卵泡發(fā)育的調(diào)控11-12
• 1.3 lncRNA研究進展12-15
• 1.3.1 lncRNA12-14
• 1.3.2 lncRNA與生殖14
• 1.3.3 lncRNA與卵巢發(fā)育14-15
• 1.4 研究目的15
• 2 材料和方法15-31
• 2.1 實驗地點和時間15
• 2.2 實驗動物15-16
• 2.3 主要儀器設備與器材16
• 2.4 主要實驗試劑16-17
• 2.5 發(fā)情周期鑒定17
• 2.5.1 陰門狀態(tài)觀察17
• 2.5.2 陰道脫落細胞涂片制作與觀察17
• 2.6 卵巢石蠟切片制作17-19
• 2.6.1 卵巢取材和組織固定17-18
• 2.6.2 小鼠卵巢石蠟切片制作與HE染色18-19
• 2.7 卵巢lncRNA篩選與過表達載體構(gòu)建19-29
• 2.7.1 qPCR篩選卵巢相對高表達lncRNA19-23
• 2.7.2 lncRNA過表達載體構(gòu)建23-29
• 2.8 lncRNA過表達載體體內(nèi)過表達實驗29-30
• 2.8.1 轉(zhuǎn)染試劑的配制29
• 2.8.2 體內(nèi)過表達實驗29-30
• 2.9 轉(zhuǎn)基因小鼠30-31
• 2.9.1 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型30-31
• 2.9.2 轉(zhuǎn)基因小鼠子代基因型鑒定31
• 2.9.3 轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育31
• 2.9.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析31
• 3 實驗結(jié)果31-48
• 3.1.lncRNA基因庫篩選結(jié)果31-32
• 3.2 小鼠發(fā)情周期不同階段陰門外觀和陰道脫落細胞涂片觀察32
• 3.3 組織總RNA樣品質(zhì)量檢測結(jié)果32-34
• 3.4 驗證基因芯片篩選得到lncRNA的qPCR引物擴增效率和特異性34-37
• 3.5 表達上調(diào)lncRNA在各組織中的表達水平37-38
• 3.6 lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274在不同發(fā)育階段卵巢中的表達水平38
• 3.7 發(fā)情周期不同階段卵巢中l(wèi)ncRNA647、lncRNA147和lncRNA274的表達水平38-39
• 3.8 成功構(gòu)建lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274過表達載體39-40
• 3.9 lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274在小鼠卵巢中的功能40-44
• 3.10 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定和表型分析44-48
• 4 討論48-50
• 5 總結(jié)50
• 致謝50-51
• 參考文獻51-55
• 碩士研究生期間所獲科研成果55-56
• 碩士期間參與的科研項目56

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 陳振國;許錦階;羅麗莉;莊曉蘭;孔曉霞;傅玉才;;姜黃素對新生大鼠卵巢卵泡發(fā)育和卵母細胞凋亡的影響[J];汕頭大學醫(yī)學院學報;2009年04期

2 張慶海;魏微;蘇雷;;哺乳動物優(yōu)勢卵泡選擇的研究進展[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2009年13期

3 翟青新;招霞;哈惠馨;;小鼠的生殖特性及陰栓[J];實驗動物科學;2009年02期

4 朱桂金;;黃體生成素在卵泡發(fā)育中的作用和黃體生成素峰[J];生殖醫(yī)學雜志;2007年05期

5 豐培金,牛淑玲,周虛;卵泡刺激素受體研究進展[J];生殖醫(yī)學雜志;2003年05期

6 李俊杰,賈青,張正珊;雌性哺乳動物促卵泡素受體與促黃體素受體的結(jié)構(gòu)與表達[J];生命的化學;2003年04期

，

本文編號：798432