本文關(guān)鍵詞：用于診斷四種禽呼吸道疫病病毒可視化芯片的構(gòu)建及初步應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 禽呼吸道疫病 不對稱PCR技術(shù) 寡核苷酸 可視化基因芯片 診斷

【摘要】：禽流感、新城疫、雞傳染性支氣管炎和傳染性喉氣管炎是雞群常見的四種呼吸道疫病。它們的發(fā)病癥狀和剖解病理變化相似,病死率較高,給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。因此,對于四種疫病的鑒別診斷對防控具有重要意義。本研究是在傳統(tǒng)基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合不對稱PCR技術(shù),將生物素標(biāo)記的不對稱PCR擴增產(chǎn)物與寡核苷酸芯片雜交,然后與辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)包被的鏈霉親和素反應(yīng),用二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)對該雜交體系顯色后,陽性信號能夠以肉眼可見的棕色斑點呈現(xiàn)。該研究建立的可視化寡核昔酸基因芯片技術(shù)可以對禽流感、新城疫、雞傳染性支氣管炎和雞傳染性喉氣管炎進行同時鑒別診斷,為雞呼吸道疫病的臨床診斷提供了新的技術(shù)。1.AIV的NP基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及寡核苷酸探針的設(shè)計根據(jù)Genbank中收錄的基因序列,對AIV的保守基因NP,設(shè)計一對特異性引物,目的片段的長度為272 bp。以分離株H9為材料提取RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。然后以cDNA為模板,經(jīng)PCR擴增獲得NP基因擴增產(chǎn)物。將所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與pMD19-T載體連接,然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a,經(jīng)PCR擴增和核酸序列測定鑒定,成功克隆出AIV-NP基因的重組質(zhì)粒；同時成功復(fù)蘇本實驗室前期保存的NDV的F基因、IBV的N基因和ILTV的TK基因的凍干重組質(zhì)粒菌。以AIV-NP、NDV-F、IBV-N和ILTV-TK靶基因核酸序列片段的正義鏈為模板,用Oligo7.0軟件設(shè)計兩條寡核苷酸探針,長度為40 bρ左右,Tm值為80℃左右,探針經(jīng)BLAST分析,確定各探針的特異性良好。2. AIV-NDV-IBV-ILTV共檢可視化芯片的構(gòu)建及條件優(yōu)化基因芯片的制備：用微陣列芯片噴樣系統(tǒng)晶芯(?)Smart ArrayerTM 16在尼龍膜上噴制芯片。噴制前先將尼龍膜在超純水中浸泡30 mmin待干燥后,將寡核苷酸探針與點樣緩沖液充分混合,調(diào)整探針到合適濃度后,將探針點制到芯片上,待探針完全固定后,在紫外燈下交聯(lián)30 min,然后將制備好的芯片在4℃下密封保存。不對稱PCR擴增技術(shù)：優(yōu)化生物素標(biāo)記的上游引物與未標(biāo)記的下游引物的濃度比例,提高擴增的循環(huán)次數(shù),控制模板濃度,用高濃度的瓊脂糖凝膠在低電壓條件下檢測擴增的單鏈情況。結(jié)果表明,在反應(yīng)體系中當(dāng)生物素標(biāo)記的上游引物與下游引物在10：1時,所獲單鏈產(chǎn)物最多。芯片制備與檢測技術(shù)條件的優(yōu)化：對芯片制備和芯片檢測技術(shù)中的各項檢測條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明：當(dāng)噴樣次數(shù)為1次；探針濃度為25 μ M；雜交時間為1 h；雜交溫度為50℃；濃度為1.0mg/mL Streptavidin HRP Conjugate稀釋2000倍;DAB顯色時間為5 min時,芯片檢測技術(shù)的結(jié)果最佳,確立了共檢芯片技術(shù)檢測的標(biāo)準(zhǔn)條件。3. AIV-NDV-IBV-ILTV可視化共檢可視化芯片的質(zhì)量評價本研究對構(gòu)建的AIV-NDV-IBV-ILTV共檢可視化芯片進行了特異性、敏感性和保存期研究。結(jié)果表明,本研究所構(gòu)建的芯片特異性良好；敏感性試驗結(jié)果顯示最低可檢測出靶基因濃度為1.0×10-5μ g/μl；隨機抽取保存不同時間的3張芯片進行檢測,結(jié)果該芯片在保存180 d時仍可檢測；采用本研究所構(gòu)建的可視化芯片技術(shù)和實驗室常規(guī)的RT-PCR/PCR技術(shù)同時對采自川渝地區(qū)的96份臨床組織樣品進行檢測,結(jié)果兩種方法的檢測結(jié)果符合率為100%。本研究構(gòu)建的AIV-NDV-IBV-ILTV共檢可視化芯片,為雞病診斷提供了新的技術(shù)。
【關(guān)鍵詞】：禽呼吸道疫病 不對稱PCR技術(shù) 寡核苷酸 可視化基因芯片 診斷
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 符號說明9-15
• 第一章 文獻綜述15-31
• 1. 四種禽呼吸道疾病及其病原學(xué)特征15-21
• 1.1 禽流感概述15-16
• 1.1.1 禽流感病毒病原學(xué)特征15-16
• 1.1.2 禽流感病毒NP基因的研究16
• 1.2 新城疫概述16-18
• 1.2.1 新城疫病毒病原學(xué)特征17
• 1.2.2 新城疫病毒F基因研究17-18
• 1.3 雞傳染性支氣管炎概述18-19
• 1.3.1 雞傳染性支氣管炎病毒病原學(xué)特征18-19
• 1.3.2 雞傳染性支氣管炎病毒N基因研究19
• 1.4 雞傳染性喉氣管炎概述19-21
• 1.4.1 傳染性喉氣管炎病毒病學(xué)原學(xué)研究20
• 1.4.2 雞傳染性喉氣管炎病毒TK基因研究20-21
• 2. 禽呼吸道疾病的常見診斷方法21-25
• 2.1 病毒分離及電鏡觀察21-22
• 2.2 免疫學(xué)診斷方法22-24
• 2.2.1 病毒中和試驗22
• 2.2.2 血凝試驗及血凝抑制試驗22
• 2.2.3 瓊脂擴散試驗22-23
• 2.2.4 免疫熒光試驗23
• 2.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗23
• 2.2.6 膠體金技術(shù)23-24
• 2.3 分子生物學(xué)診斷方法24-25
• 2.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)24
• 2.3.2 實時熒光定量PCR24
• 2.3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增24-25
• 3. 傳統(tǒng)基因芯片技術(shù)在雞疫病檢測方面的應(yīng)用25-27
• 3.1 基因表達譜分析25-26
• 3.2 基因分型檢測26
• 3.3 疾病診斷26-27
• 4. 可視化芯片應(yīng)用的研究進展27-30
• 4.1 可視化基因芯片的研究原理27-28
• 4.2 可視化芯片技術(shù)的應(yīng)用研究28-30
• 4.2.1 可視化芯片對蛋白質(zhì)的檢測29
• 4.2.2 可視化芯片對病原微生物的檢測29
• 4.2.3 可視化芯片在其他方面的應(yīng)用29-30
• 5. 本研究的目的與意義30-31
• 第二章 AIV-NP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及靶基因的復(fù)蘇31-43
• 1 材料31-32
• 1.1 生物材料31
• 1.2 主要試驗儀器31
• 1.3 主要試劑31-32
• 2 方法32-38
• 2.1 AIV的NP基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建32-36
• 2.1.1 引物設(shè)計32
• 2.1.2 AIV基因組的抽提32-33
• 2.1.3 禽流感的RT-PCR及PCR擴增33
• 2.1.4 AIV-NP基因的膠回收33-34
• 2.1.5 AIV-NP基因的連接34
• 2.1.6 AIV-NP基因的轉(zhuǎn)化34-35
• 2.1.7 AIV-NP基因重組質(zhì)粒鑒定35-36
• 2.1.8 AIV-NP基因重組質(zhì)粒菌的保存36
• 2.2 靶基因的復(fù)蘇及驗證36-38
• 2.2.1 靶基因的復(fù)蘇36
• 2.2.2 靶基因的驗證36-38
• 3 結(jié)果與分析38-40
• 3.1 AIV-NP基因PCR鑒定結(jié)果38
• 3.2 AIV-NP基因重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果38-39
• 3.3 AIV-NP基因測序及同源性分析結(jié)果39-40
• 3.4 靶基因復(fù)蘇驗證結(jié)果40
• 4 討論40-42
• 4.1 靶基因的選擇40-41
• 4.2 靶基因長度的選擇41
• 4.3 靶基因的驗證41-42
• 5 小結(jié)42-43
• 第三章 AIV-NDV-IBV-ILTV可視化芯片的構(gòu)建及評價43-61
• 1 材料43-44
• 1.1 生物材料43
• 1.2 主要試驗儀器43
• 1.3 芯片雜交材料與試劑43
• 1.4 其他主要材料與試劑43-44
• 1.5 臨床樣品44
• 2 方法44-48
• 2.1 寡核苷酸探針設(shè)計和合成44-45
• 2.2 芯片的制備45
• 2.3 不對稱PCR引物濃度的優(yōu)化45-46
• 2.4 可視化芯片檢測的步驟46
• 2.4.1 雜交46
• 2.4.2 封閉46
• 2.4.3 酶聯(lián)46
• 2.4.4 顯色46
• 2.5 可視化基因芯片的優(yōu)化46-47
• 2.5.1 探針基因噴樣濃度的選擇46-47
• 2.5.2 重復(fù)噴樣次數(shù)的選擇47
• 2.5.3 芯片雜交時間的選擇47
• 2.5.4 芯片雜交溫度的優(yōu)化47
• 2.5.5 Streptavidin HRP Conjugate濃度的優(yōu)化47
• 2.5.6 底物(DAB)顯色時間的選擇47
• 2.6 AIV-NDV-IBV-ILTV可視化共檢芯片有效性評價47-48
• 2.6.1 芯片檢測特異性檢驗47-48
• 2.6.2 芯片檢測靈敏性檢驗48
• 2.6.3 芯片保存期檢驗48
• 2.7 AIV-NDV-IBV-ILTV可視化共檢芯片的初步應(yīng)用48
• 3 結(jié)果與分析48-57
• 3.1 不對稱PCR引物比例優(yōu)化結(jié)果48-49
• 3.2 探針基因重復(fù)噴樣次數(shù)選擇結(jié)果49
• 3.3 寡核苷酸探針噴樣濃度選擇結(jié)果49-50
• 3.4 AIV-NDV-IBV-ILTV可視化芯片雜交溫度的優(yōu)化結(jié)果50-51
• 3.5 AIV-NDV-IBV-ILTV可視化芯片雜交時間優(yōu)化結(jié)果51-52
• 3.6 Streptavidin HRP Conjugate稀釋倍數(shù)的優(yōu)化結(jié)果52-53
• 3.7 底物顯色時間優(yōu)化結(jié)果53-54
• 3.8 AIV-NDV-IBV-ILTV可視化共檢基因芯片的有效性54-55
• 3.9 AIV-NDV-IBV-ILTV可視化共檢基因芯片的特異性55
• 3.10 AIV-NDV-IBV-ILTV可視化共檢基因芯片的靈敏性55-56
• 3.11 AIV-NDV-IBV-ILTV可視化共檢基因芯片的保存期56
• 3.12 AIV-NDV-IBV-ILTV可視化共檢芯片的臨床應(yīng)用56-57
• 4 討論57-60
• 4.1 關(guān)于不對稱PCR技術(shù)的討論57-58
• 4.2 關(guān)于可視化芯片的條件優(yōu)化的討論58
• 4.3 關(guān)于可視化芯片質(zhì)量評價的討論58-59
• 4.4 關(guān)于可視化芯片臨床應(yīng)用的討論59-60
• 5 小結(jié)60-61
• 研究創(chuàng)新點61-62
• 參考文獻62-69
• 致謝69-70
• 附錄70-75
• 附錄一：靶基因序列信息70-72
• 附錄二：臨床樣本信息表72-73
• 附錄三：部分臨床樣本檢測結(jié)果圖73-75
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文75

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