本文關(guān)鍵詞：黃芪多糖調(diào)控種公雞睪丸差異表達miRNA的鑒定和功能分析

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【摘要】：種公雞養(yǎng)殖是肉雞生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),種公雞的繁殖性能會直接影響種蛋的受精率、孵化率和商品代肉雞生長表現(xiàn)。睪丸作為種公雞的性腺,其良好的代謝及免疫狀況可保證種公雞具有良好的繁殖性能,從而確保種公雞在肉雞生產(chǎn)中的健康高效利用。黃芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)是一種高效綠色免疫調(diào)節(jié)劑,可顯著改善動物體的免疫機能,還能調(diào)控動物體的代謝過程。本研究在種公雞日糧中添加APS,研究APS對睪丸miRNA表達的影響,并闡明差異表達miRNA在睪丸代謝及免疫過程中所發(fā)揮的作用。試驗一APS調(diào)控種公雞睪丸組織mi RNA的差異表達本試驗通過small RNA-seq方法篩選種公雞睪丸中由于飼糧添加APS而引起的差異表達miRNA。選取1日齡科寶500肉雞父母代種公雞64只,隨機分為空白對照組(Control組)和APS處理組,每個處理4個重復,每個重復8只雞。對照組飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧,APS處理組在每千克基礎(chǔ)飼糧中額外添加10克APS,種公雞飼養(yǎng)40周時,對各處理睪丸組織進行高通量測序。結(jié)果表明,在種公雞睪丸中共發(fā)現(xiàn)1305種miRNA,584個miRNA共表達于種公雞睪丸Control組和APS組,有79和76個miRNA分別單獨存在于Control組和APS組。miRNA差異表達分析結(jié)果表明,種公雞飼糧添加APS可顯著改變種公雞睪丸miRNA的表達情況,共鑒定出33個差異表達mi RNA,其中16個miRNA上調(diào),17個miRNA下調(diào)。隨機選取7個差異表達miRNA進行實時定量PCR驗證,結(jié)果表明測序結(jié)果準確性較高,可代表睪丸組織樣品真實的miRNA表達狀況。試驗二APS調(diào)控差異表達miRNA的靶基因預測及功能驗證本試驗在高通量測序篩選差異表達miRNA的基礎(chǔ)上,對顯著差異表達的mi RNA進行靶基因預測,并結(jié)合miRNA靶基因的GO和KEGG信號通路功能富集分析探索APS對睪丸器官功能狀態(tài)的影響。GO和KEGG信號通路功能富集分析發(fā)現(xiàn),篩選到的差異表達miRNA可調(diào)控睪丸的物質(zhì)代謝過程,包括核苷酸代謝(GO:0009117),蛋白水解的調(diào)節(jié)(GO:0030162),磷脂的生物合成過程(GO:0008654),丙酸代謝(ko00640),脂肪酸代謝(ko00071),以及包括半胱氨酸和蛋氨酸代謝(ko00270)和煙酸和煙酰胺代謝(ko00760)在內(nèi)的一碳單位代謝過程等代謝途徑(ko01100),這些代謝都與睪丸發(fā)育和功能發(fā)揮密切相關(guān)。與此同時,我們發(fā)現(xiàn)APS可影響睪丸組織“自然殺傷細胞介導的細胞毒性作用”這一信號通路。通過miRNA-gene網(wǎng)絡(luò)圖分析發(fā)現(xiàn)gga-miR-16在該通路中發(fā)揮著重要作用。我們通過實時定量PCR檢測該通路中miR-16調(diào)控的4個靶基因在睪丸的表達水平,結(jié)果顯示,相較于Control組,IFNGR2和MAP2K1表達顯著降低(P0.05),MAP2K2表達顯著增加(P0.05)而SH3BP2無明顯差異(P0.05)。我們選擇與mi R-16表達作用模式相符的IFNGR2和MAP2K1作為gga-miR-16的潛在靶基因來進行后續(xù)的雙熒光素酶報告檢測,結(jié)果表明,相較于Control組及陰性對照組(mimic-NTC組),miR-16-5p mimic轉(zhuǎn)染細胞后p2-IFNGR2和p2-MAP2K1重組質(zhì)粒的螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性比值顯著降低(P0.05),表明miR-16-5p可有效結(jié)合到IFNGR2和MAP2K1 3’UTR區(qū)的靶位點。結(jié)合雙熒光素酶報告檢測及靶基因表達量的在體驗證結(jié)果,表明APS可通過下調(diào)miR-16-5p的表達進而上調(diào)IFNGR2和MAP2K1基因的表達。綜上,本研究表明種公雞日糧中添加10 g/kg APS可顯著影響種公雞睪丸中mi RNA的表達,其差異表達miRNA可調(diào)控睪丸物質(zhì)代謝及免疫調(diào)控過程,且可通過下調(diào)miR-16-5p的表達進而上調(diào)IFNGR2和MAP2K1的表達。
【關(guān)鍵詞】：APS miRNA IFNGR2 MAP2K1 睪丸 種公雞
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S831
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 文獻綜述12-22
• 1.1 APS的生物活性12-15
• 1.1.1 APS的免疫調(diào)控活性12-13
• 1.1.2 APS的抗炎活性13
• 1.1.3 APS的抗氧化作用13-14
• 1.1.4 APS的抗病毒、抗腫瘤作用14
• 1.1.5 APS對機體物質(zhì)代謝的調(diào)控作用14-15
• 1.2 營養(yǎng)表觀遺傳15-18
• 1.2.1 營養(yǎng)與DNA甲基化15
• 1.2.2 營養(yǎng)與組蛋白修飾15-16
• 1.2.3 營養(yǎng)與miRNA16-18
• 1.3 睪丸組織RNA研究進展18-20
• 1.3.1 睪丸組織結(jié)構(gòu)和功能18
• 1.3.2 睪丸miRNA表達的特征18-19
• 1.3.3 睪丸miRNA的表達調(diào)控19-20
• 1.4 研究問題的提出、研究內(nèi)容及技術(shù)路線20-22
• 1.4.1 研究問題的提出20
• 1.4.2 研究內(nèi)容20-21
• 1.4.3 技術(shù)路線21-22
• 第二章 APS調(diào)控種公雞睪丸組織miRNA的差異表達22-35
• 2.1 材料與方法22-25
• 2.1.1 試驗設(shè)計及樣品采集22
• 2.1.2 小RNA文庫的制備22-23
• 2.1.3 測序結(jié)果生物信息分析23
• 2.1.4 篩選差異表達miRNA分析23
• 2.1.5 miRNA的RT-qPCR定量驗證23-25
• 2.2 結(jié)果與分析25-31
• 2.2.1 總RNA質(zhì)量檢測25
• 2.2.2 小RNA文庫測序結(jié)果生物信息分析25-28
• 2.2.3 APS調(diào)控種公雞睪丸miRNA的差異表達分析28-31
• 2.2.4 實時定量PCR驗證測序結(jié)果31
• 2.3 討論31-34
• 2.4 小結(jié)34-35
• 第三章 APS調(diào)控差異表達miRNA靶基因預測及功能驗證35-56
• 3.1 材料與方法35-42
• 3.1.1 差異表達miRNA靶基因預測和功能注釋35
• 3.1.2 miR-16靶基因在體驗證35-37
• 3.1.3 psiCHECK2靶基因雙熒光素酶報告基因載體構(gòu)建37-40
• 3.1.4 HEK 293T細胞培養(yǎng)40
• 3.1.5 細胞轉(zhuǎn)染40-41
• 3.1.6 雙熒光素報告基因檢測41-42
• 3.2 結(jié)果與分析42-53
• 3.2.1 差異表達miRNA靶基因預測42
• 3.2.2 靶基因GO和KEGG富集性分析42-48
• 3.2.3 與自然殺傷細胞介導的細胞毒性相關(guān)的miR-16靶基因在體驗證48
• 3.2.4 靶基因psiCHECK-2 載體的鑒定48-51
• 3.2.5 細胞轉(zhuǎn)染效果51-52
• 3.2.6 雙熒光素酶活性檢測52-53
• 3.3 討論53-55
• 3.4 小結(jié)55-56
• 第四章 總體結(jié)論與建議56-57
• 4.1 本研究的主要結(jié)論56
• 4.2 有待進一步研究的問題56-57
• 參考文獻57-65
• 附錄65-69
• 致謝69-70
• 作者簡介70

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