本文關(guān)鍵詞：禽流感H9N2亞型病毒樣顆粒疫苗佐劑的篩選

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【摘要】：為使禽流感H9N2亞型病毒樣顆粒疫苗盡快投入市場(chǎng),有效防控H9N2禽流感,本課題擬從傳統(tǒng)的白油佐劑、新型的ISA 206佐劑和微球佐劑中篩選出一種最適用于禽流感H9N2亞型病毒樣顆粒疫苗的佐劑。本課題主要內(nèi)容包括以下幾個(gè)部分。1禽流感H9N2亞型病毒樣顆粒的制備本試驗(yàn)首先合成禽流感亞型H9N2病毒的HA基因、NA基因、M1基因,再將這三個(gè)基因先后插入桿狀病毒表達(dá)載體形成重組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中藍(lán)白斑篩選后提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。將篩選出的合格的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞,經(jīng)過(guò)P1代、P2代、P3代轉(zhuǎn)染,最后將P3代繼續(xù)轉(zhuǎn)染sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞,最終得到H9N2病毒樣顆粒工作液。結(jié)果顯示:H9N2病毒樣顆粒工作液為透明的淡黃色液體。2白油佐劑、ISA 206佐劑、微球佐劑病毒樣顆粒疫苗的制備與篩選2.1白油佐劑病毒樣顆粒疫苗的制備與篩選本試驗(yàn)利用本實(shí)驗(yàn)室保存的H9N2亞型病毒樣顆粒工作液,加入不同體積的白油、乳化劑和不同質(zhì)量的硬脂酸鋁采用高速分散器乳化得到不同油水比和不同硬脂酸鋁濃度的白油佐劑H9N2病毒樣顆粒疫苗。本試驗(yàn)對(duì)制備出的白油佐劑疫苗進(jìn)行了黏度檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn),結(jié)果顯示:白油佐劑疫苗的穩(wěn)定性檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn)均合格,油水比為3:1、硬脂酸鋁濃度為0.5%的白油佐劑病毒樣顆粒疫苗最適合用于后續(xù)與其他兩種佐劑之間的篩選。2.2 ISA 206佐劑病毒樣顆粒疫苗的制備與篩選本試驗(yàn)利用進(jìn)口佐劑ISA 206按體積比為1:1的比例采用連通管法乳化禽流感H9N2亞型病毒樣顆粒工作液制備出ISA 206佐劑疫苗。本試驗(yàn)對(duì)ISA 206佐劑疫苗進(jìn)行了黏度檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn),結(jié)果顯示:ISA 206佐劑H9N2亞型病毒樣顆粒疫苗黏度檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn)均合格,可用于后續(xù)與其他兩種佐劑之間的篩選。2.3微球佐劑病毒樣顆粒疫苗的制備與篩選本試驗(yàn)利用殼聚糖、吐溫80、硫酸鈉、乙酸為原料制備出微球,與本實(shí)驗(yàn)室保存的H9N2病毒樣顆粒工作液吸附得到微球佐劑疫苗。本試驗(yàn)為提高微球的載藥量和包封率優(yōu)化了微球與病毒樣顆粒工作液的吸附條件,結(jié)果顯示:微球吸附病毒樣顆粒工作液的最佳時(shí)間為3h,5mg微球最佳吸附體積為8m L,載藥量可達(dá)89.04%。本試驗(yàn)對(duì)微球佐劑疫苗進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示:微球佐劑H9N2病毒樣顆粒疫苗的穩(wěn)定性檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn)結(jié)果均為合格,可用于后續(xù)與其他兩種佐劑之間的篩選。3不同佐劑禽流感H9N2亞型病毒樣顆粒疫苗免疫效果評(píng)定為篩選出禽流感H9N2亞型病毒樣顆粒疫苗的最優(yōu)佐劑,本試驗(yàn)將試驗(yàn)雛雞隨機(jī)分組并對(duì)各組雛雞免疫前后出現(xiàn)的臨床體征、溶菌酶含量、體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平進(jìn)行測(cè)定。臨床體征檢測(cè)包括對(duì)各試驗(yàn)組進(jìn)行采食量、體溫、呼吸頻率、體重、注射部位是否出現(xiàn)局部或全身反應(yīng),以及各試驗(yàn)組雛雞精神狀況和排泄物是否正常等方面的檢測(cè)。結(jié)果顯示:免疫前后各試驗(yàn)組食欲無(wú)肉眼可見(jiàn)變化;各組試驗(yàn)蛋雞的體溫、呼吸頻率、體重均無(wú)顯著差異(P0.05);白油佐劑疫苗和標(biāo)準(zhǔn)商品化疫苗在注射試驗(yàn)雛雞后會(huì)引起局部反應(yīng);不加佐劑的病毒樣顆粒疫苗組、微球佐劑病毒樣顆粒疫苗組、生理鹽水組、微球佐劑陰性對(duì)照組在首次免疫后,其精神狀況比其他各組好。溶菌酶含量的高低是反映動(dòng)物機(jī)體非特異性免疫水平高低的一個(gè)指標(biāo)。對(duì)溶菌酶含量的測(cè)定結(jié)果顯示:21日齡時(shí),微球佐劑病毒樣顆粒疫苗口服組和微球口服陰性對(duì)照組的溶菌酶含量極顯著高于其他組的溶菌酶含量(P0.01),微球佐劑病毒樣顆粒疫苗口服組和微球口服陰性對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P0.05);14日齡和35日齡時(shí),各組間溶菌酶的含量均無(wú)顯著差異(P0.05)。本試驗(yàn)用甲醛和戊二醛分別制備了醛化紅細(xì)胞并測(cè)定了其保存時(shí)間,結(jié)果顯示:制備的兩種醛化紅細(xì)胞存放9個(gè)月時(shí),其被H9N2尿囊液凝集的效果與新鮮紅細(xì)胞無(wú)顯著差異(P0.05);兩種醛化紅細(xì)胞放置12個(gè)月時(shí),新鮮紅細(xì)胞被H9尿囊液凝集的效果極顯著高于醛化紅細(xì)胞組(P0.01)。本試驗(yàn)對(duì)免疫后各時(shí)期的各試驗(yàn)組進(jìn)行了體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平的測(cè)定,結(jié)果顯示:不添加佐劑的病毒樣顆粒進(jìn)入機(jī)體后產(chǎn)生了有效的體液免疫水平,但其持續(xù)時(shí)間短、抗體水平低;添加了佐劑的病毒樣顆粒疫苗進(jìn)入試驗(yàn)蛋雞機(jī)體內(nèi),均產(chǎn)生了有效的體液免疫水平,且它們的持續(xù)時(shí)間和抗體水平更長(zhǎng)、更高;其中微球佐劑禽流感H9N2亞型病毒樣顆粒疫苗口服組的體液免疫水平比白油佐劑疫苗組、ISA 206佐劑疫苗組和微球佐劑疫苗注射組都要高且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng);各試驗(yàn)組均未產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫水平。研究表明:白油佐劑、ISA206佐劑、微球佐劑這三種佐劑中,微球佐劑比其他兩種佐劑更適合用于禽流感H9N2亞型病毒樣顆粒疫苗的佐劑。微球佐劑疫苗口服的免疫途徑比注射的免疫途徑更方便,且能獲得更高的體液免疫水平和更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間。
【關(guān)鍵詞】：禽流感 H9N2亞型 病毒樣顆粒 疫苗佐劑
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.4
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第1章 文獻(xiàn)綜述10-20
• 1 禽流感10-12
• 1.1 病原學(xué)10-11
• 1.2 流行病學(xué)11
• 1.3 抗原變異11-12
• 1.4 防控措施12
• 2 H9N2亞型禽流感臨床癥狀與病理組織學(xué)變化12-13
• 2.1 H9N2亞型禽流感臨床癥狀12
• 2.2 H9N2亞型禽流感病理組織學(xué)變化12-13
• 3 疫苗13-15
• 3.1 傳統(tǒng)疫苗13
• 3.2 新型疫苗13-15
• 4 佐劑15-18
• 4.1 佐劑概述15-16
• 4.2 佐劑分類16-18
• 5 結(jié)語(yǔ)18-20
• 第2章 引言20-22
• 第3章 禽流感H9N2亞型病毒樣顆粒的制備22-26
• 1 材料22
• 2 方法22-24
• 3 結(jié)果24
• 4 討論24-25
• 本章小結(jié)25-26
• 第4章 不同佐劑H9N2亞型VLP疫苗的制備與篩選26-38
• 1 材料26-27
• 2 方法27-30
• 2.1 白油佐劑VLP疫苗的制備與篩選27-28
• 2.2 ISA 206佐劑VLP疫苗的制備與篩選28-29
• 2.3 微球佐劑VLP疫苗的制備與篩選29-30
• 3 結(jié)果30-35
• 3.1 白油佐劑VLP疫苗的制備與篩選結(jié)果30-31
• 3.2 ISA 206佐劑VLP疫苗的制備與篩選結(jié)果31
• 3.3 微球佐劑VLP疫苗的制備與篩選結(jié)果31-35
• 4 討論35-36
• 本章小結(jié)36-38
• 第5章 不同佐劑禽流感H9N2亞型VLP疫苗免疫效果的評(píng)定38-58
• 1 材料38-39
• 2 方法39-42
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組39
• 2.2 免疫次數(shù)與途徑39-40
• 2.3 免疫劑量40-41
• 2.4 各試驗(yàn)組免疫后出現(xiàn)的臨床體征41
• 2.5 溶菌酶含量測(cè)定41
• 2.6 體液免疫水平測(cè)定41-42
• 2.7 細(xì)胞免疫水平測(cè)定42
• 3 結(jié)果42-54
• 3.1 免疫前后臨床體征變化情況42-45
• 3.2 溶菌酶含量測(cè)定結(jié)果45-46
• 3.3 體液免疫水平測(cè)定結(jié)果46-53
• 3.4 細(xì)胞免疫水平測(cè)定結(jié)果53-54
• 4 討論54-57
• 本章小結(jié)57-58
• 結(jié)論58-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 附錄64-70
• 致謝70-72
• 在學(xué)期間所發(fā)表的文章72

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6 王，

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