本文關(guān)鍵詞：miR-101作用于ING3的功能研究及對(duì)牛核移植胚胎發(fā)育的影響

  更多相關(guān)文章： mi R-101 ING3 體細(xì)胞核移植 胚胎發(fā)育 牛

【摘要】：SCNT(體細(xì)胞核移植技術(shù))是現(xiàn)代生物技術(shù)的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù),在家畜優(yōu)良個(gè)體擴(kuò)繁、轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及生物制藥等方面已廣泛應(yīng)用。然而,目前體細(xì)胞核移植因?yàn)椴煌耆鼐幊痰纫蛩?克隆動(dòng)物出生效率低,異常發(fā)育個(gè)體比例較高,影響SCNT技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,提高核移植重編程效率和促進(jìn)核移植胚胎的正常發(fā)育是目前生物繁殖領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。大量的報(bào)道顯示,microRNAs在SCNT胚胎早期發(fā)育過(guò)程中有不可忽略的功能。mi R-101是在牛體細(xì)胞和卵母細(xì)胞中均高表達(dá)的一種miRNA,在癌細(xì)胞中miR-101主要調(diào)控細(xì)胞的凋亡與增殖,而在牛胚胎發(fā)育中作用目前還不清楚。為此,本研究以牛皮膚成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象,利用熒光素酶報(bào)告分析(Luciferase Reporter assay)和免疫印跡(Western blot)方法驗(yàn)證了miR-101的一個(gè)靶基因ING3;用實(shí)時(shí)定量PCR(Real time PCR)和流式細(xì)胞分析(Flow cytometry)等方法研究了miR-101及其靶基因在牛SCNT供核細(xì)胞中的作用;最后評(píng)估了miR-101對(duì)體細(xì)胞核移植胚胎的卵裂率、囊胚率以及囊胚質(zhì)量的影響。得到了以下研究結(jié)果:1、擴(kuò)增miR-101對(duì)應(yīng)的脫氧核酸序列和包含預(yù)測(cè)靶基因種子序列的片段分別插入到PCDH-513-B1過(guò)表達(dá)載體和PsiCHECKTM-2報(bào)告載體的多克隆位點(diǎn),構(gòu)建mi R-101-513-B1過(guò)表達(dá)載體和WT-ING3-PsiCHECKTM-2報(bào)告載體,用重疊延伸PCR的方法擴(kuò)增得到預(yù)測(cè)靶基因種子序列突變序列,連接到PsiCHECKTM-2報(bào)告載體上,得到MUT-ING3-PsiCHECKTM-2報(bào)告載體,測(cè)序結(jié)果表明與預(yù)期一致。用上述重組質(zhì)粒分組共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系(人腎上皮細(xì)胞系),熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)分析miR-101與ING3的3’UTR種子序列的結(jié)合作用。表明,miR-101直接靶向作用于ING3的3’UTR序列。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-101-513-B1于牛成纖維細(xì)胞(PCDH-513-B1空載體作為對(duì)照),Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),mi R-101可以抑制牛成纖維細(xì)胞中ING3蛋白的表達(dá)。2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選了整合miR-101牛成纖維克隆細(xì)胞(miR-101-BFF)和空載體(PCDH-513-B1)牛成纖維克隆細(xì)胞(513-B1-BFF),利用實(shí)時(shí)定量PCR、流式分析和細(xì)胞增殖曲線測(cè)定的方法檢測(cè)了miR-101和ING3在牛成纖維細(xì)胞中的功能。發(fā)現(xiàn)mi R-101不僅抑制ING3基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),同時(shí)也抑制相關(guān)基因P53、P21、UHRF1、BAX和DNMT3A的表達(dá);流式細(xì)胞分析可知miR-101抑制了細(xì)胞的凋亡,同時(shí)縮短了細(xì)胞周期;細(xì)胞增殖曲線分析結(jié)果顯示miR-101-BFF增殖最快,與流式分析結(jié)果一致。3、為進(jìn)一步研究miR-101對(duì)SCNT胚胎發(fā)育的影響,本研究以miR-101-BFF為試驗(yàn)供核細(xì)胞,以513-B1-BFF為對(duì)照供核細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植,檢測(cè)胚胎發(fā)育到第2天的卵裂率和第7天的囊胚率。結(jié)果顯示miR-101-BFF組的囊胚率(35.75%)高于對(duì)照組(26.06%)(P0.05);通過(guò)細(xì)胞凋亡染色檢測(cè),發(fā)現(xiàn)miR-101-BFF組的囊胚凋亡率低于對(duì)照組(P0.05);實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)胚胎發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá),結(jié)果表明,OCT4和SOX2基因的表達(dá)量在miR-101-BFF試驗(yàn)高于均照組(P0.05)。
【關(guān)鍵詞】：mi R-101 ING3 體細(xì)胞核移植 胚胎發(fā)育 牛
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 文獻(xiàn)綜述13-22
• 第一章 microRNA和體細(xì)胞核移植13-22
• 1.1 microRNA與體細(xì)胞核移植胚胎早期發(fā)育13-16
• 1.1.1 體細(xì)胞核移植重編程13-14
• 1.1.2 microRNA在胚胎早期發(fā)育中的研究進(jìn)展14-16
• 1.2 microRNA 101與體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育16-18
• 1.2.1 microRNA-101的研究進(jìn)展16-17
• 1.2.2 mi R-101與早期胚胎發(fā)育17-18
• 1.3 ING3與體細(xì)胞核移植胚胎18-21
• 1.3.1 ING3的研究進(jìn)展18-20
• 1.3.2 ING3對(duì)早期胚胎發(fā)育的影響20-21
• 1.4 目的意義21-22
• 實(shí)驗(yàn)部分22-57
• 第二章 牛miR-101靶基因的驗(yàn)證22-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-23
• 2.1.1 質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞株22
• 2.1.2 試劑22
• 2.1.3 儀器設(shè)備22-23
• 2.1.4 溶液配制23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-33
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)23
• 2.2.2 模板的提取23-24
• 2.2.3 mi R101PCDH513B1過(guò)表達(dá)載體和預(yù)測(cè)靶基因報(bào)告載體構(gòu)建24-27
• 2.2.4 構(gòu)建靶基因MUT-PsiCHECKTM-2 報(bào)告載體27-28
• 2.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染28-29
• 2.2.6 熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析29-30
• 2.2.7 WESTERN BLOT30-33
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-38
• 2.3.1 mi R-101與預(yù)測(cè)靶基因 3’UTR結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)33
• 2.3.2 mi R101PCDH513B1過(guò)表達(dá)載體和 3’UTR- PsiCHECKTM-2 載體構(gòu)建33-36
• 2.3.3 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)36-38
• 2.3.4 Western blot檢測(cè)miR-101對(duì)ING3蛋白表達(dá)的影響38
• 2.4 討論38-39
• 2.4.1 過(guò)表達(dá)載體與報(bào)告載體構(gòu)建38
• 2.4.2 驗(yàn)證mi R-101的直接靶基因38-39
• 2.5 小結(jié)39-40
• 第三章 牛miR-101和靶基因在牛成纖維細(xì)胞功能的研究40-49
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料40-41
• 3.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞40
• 3.1.2 試劑40
• 3.1.3 儀器設(shè)備40-41
• 3.1.4 溶液配制41
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法41-44
• 3.2.1 細(xì)胞的解凍與培養(yǎng)41
• 3.2.2 細(xì)胞電轉(zhuǎn)染41
• 3.2.3 細(xì)胞篩選41-42
• 3.2.4 陽(yáng)性細(xì)胞中mi R-101過(guò)表達(dá)檢測(cè)42-43
• 3.2.5 mi R-101對(duì)靶基因及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響43
• 3.2.6 CCK-8 檢測(cè)篩選細(xì)胞的增殖曲線43-44
• 3.2.7 流式檢測(cè)篩選細(xì)胞的凋亡與周期44
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-47
• 3.3.1 陽(yáng)性細(xì)胞的篩選44-45
• 3.3.2 mi R101513-B1過(guò)表達(dá)效率的檢測(cè)45
• 3.3.3 mi R-101對(duì)靶基因及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響45-46
• 3.3.4 牛成纖維細(xì)胞增殖曲線測(cè)定46
• 3.3.5 流式檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡46-47
• 3.4 討論47-48
• 3.4.1 mi R-101過(guò)表達(dá)效率檢測(cè)47-48
• 3.4.2 mi R-101靶基因及相關(guān)基因mRNA水平表達(dá)量檢測(cè)48
• 3.4.3 mi R-101對(duì)細(xì)胞增殖的影響48
• 3.4.4 mi R-101對(duì)細(xì)胞周期與凋亡的影響48
• 3.5 小結(jié)48-49
• 第四章 miR-101對(duì)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育的影響49-57
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料49-51
• 4.1.1 材料49
• 4.1.2 試劑49
• 4.1.3 儀器49
• 4.1.4 溶液配制49-51
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法51-53
• 4.2.1 卵母細(xì)胞的采集與體外成熟51
• 4.2.2 體細(xì)胞核移植51-52
• 4.2.3 囊胚的凋亡染色52
• 4.2.4 胚胎發(fā)育相關(guān)基因mRNA水平的表達(dá)52-53
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-55
• 4.3.1 mi R-101對(duì)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育率的影響53
• 4.3.2 mi R-101對(duì)體細(xì)胞核移植胚胎質(zhì)量的影響53-54
• 4.3.3 mi R-101對(duì)核移植胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響54-55
• 4.4 討論55-56
• 4.4.1 mi R-101對(duì)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育的影響55
• 4.4.2 mi R-101對(duì)體細(xì)胞核移植胚胎質(zhì)量的影響55-56
• 4.5 小結(jié)56-57
• 全文結(jié)論57-58
• 創(chuàng)新點(diǎn)和后續(xù)研究58-59
• 參考文獻(xiàn)59-68
• 致謝68-69
• 作者簡(jiǎn)介69

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