本文關(guān)鍵詞：miR-101作用于ING3的功能研究及對牛核移植胚胎發(fā)育的影響

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【摘要】：SCNT(體細胞核移植技術(shù))是現(xiàn)代生物技術(shù)的一項關(guān)鍵技術(shù),在家畜優(yōu)良個體擴繁、轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及生物制藥等方面已廣泛應(yīng)用。然而,目前體細胞核移植因為不完全重編程等因素,克隆動物出生效率低,異常發(fā)育個體比例較高,影響SCNT技術(shù)的進一步發(fā)展,提高核移植重編程效率和促進核移植胚胎的正常發(fā)育是目前生物繁殖領(lǐng)域研究的一個熱點問題。大量的報道顯示,microRNAs在SCNT胚胎早期發(fā)育過程中有不可忽略的功能。mi R-101是在牛體細胞和卵母細胞中均高表達的一種miRNA,在癌細胞中miR-101主要調(diào)控細胞的凋亡與增殖,而在牛胚胎發(fā)育中作用目前還不清楚。為此,本研究以牛皮膚成纖維細胞為研究對象,利用熒光素酶報告分析(Luciferase Reporter assay)和免疫印跡(Western blot)方法驗證了miR-101的一個靶基因ING3;用實時定量PCR(Real time PCR)和流式細胞分析(Flow cytometry)等方法研究了miR-101及其靶基因在牛SCNT供核細胞中的作用;最后評估了miR-101對體細胞核移植胚胎的卵裂率、囊胚率以及囊胚質(zhì)量的影響。得到了以下研究結(jié)果:1、擴增miR-101對應(yīng)的脫氧核酸序列和包含預(yù)測靶基因種子序列的片段分別插入到PCDH-513-B1過表達載體和PsiCHECKTM-2報告載體的多克隆位點,構(gòu)建mi R-101-513-B1過表達載體和WT-ING3-PsiCHECKTM-2報告載體,用重疊延伸PCR的方法擴增得到預(yù)測靶基因種子序列突變序列,連接到PsiCHECKTM-2報告載體上,得到MUT-ING3-PsiCHECKTM-2報告載體,測序結(jié)果表明與預(yù)期一致。用上述重組質(zhì)粒分組共轉(zhuǎn)染293T細胞系(人腎上皮細胞系),熒光素酶報告實驗分析miR-101與ING3的3’UTR種子序列的結(jié)合作用。表明,miR-101直接靶向作用于ING3的3’UTR序列。瞬時轉(zhuǎn)染miR-101-513-B1于牛成纖維細胞(PCDH-513-B1空載體作為對照),Western blot檢測發(fā)現(xiàn),mi R-101可以抑制牛成纖維細胞中ING3蛋白的表達。2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選了整合miR-101牛成纖維克隆細胞(miR-101-BFF)和空載體(PCDH-513-B1)牛成纖維克隆細胞(513-B1-BFF),利用實時定量PCR、流式分析和細胞增殖曲線測定的方法檢測了miR-101和ING3在牛成纖維細胞中的功能。發(fā)現(xiàn)mi R-101不僅抑制ING3基因轉(zhuǎn)錄水平的表達,同時也抑制相關(guān)基因P53、P21、UHRF1、BAX和DNMT3A的表達;流式細胞分析可知miR-101抑制了細胞的凋亡,同時縮短了細胞周期;細胞增殖曲線分析結(jié)果顯示miR-101-BFF增殖最快,與流式分析結(jié)果一致。3、為進一步研究miR-101對SCNT胚胎發(fā)育的影響,本研究以miR-101-BFF為試驗供核細胞,以513-B1-BFF為對照供核細胞進行體細胞核移植,檢測胚胎發(fā)育到第2天的卵裂率和第7天的囊胚率。結(jié)果顯示miR-101-BFF組的囊胚率(35.75%)高于對照組(26.06%)(P0.05);通過細胞凋亡染色檢測,發(fā)現(xiàn)miR-101-BFF組的囊胚凋亡率低于對照組(P0.05);實時定量PCR檢測胚胎發(fā)育相關(guān)基因的表達,結(jié)果表明,OCT4和SOX2基因的表達量在miR-101-BFF試驗高于均照組(P0.05)。
【關(guān)鍵詞】：mi R-101 ING3 體細胞核移植 胚胎發(fā)育 牛
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 文獻綜述13-22
• 第一章 microRNA和體細胞核移植13-22
• 1.1 microRNA與體細胞核移植胚胎早期發(fā)育13-16
• 1.1.1 體細胞核移植重編程13-14
• 1.1.2 microRNA在胚胎早期發(fā)育中的研究進展14-16
• 1.2 microRNA 101與體細胞核移植胚胎發(fā)育16-18
• 1.2.1 microRNA-101的研究進展16-17
• 1.2.2 mi R-101與早期胚胎發(fā)育17-18
• 1.3 ING3與體細胞核移植胚胎18-21
• 1.3.1 ING3的研究進展18-20
• 1.3.2 ING3對早期胚胎發(fā)育的影響20-21
• 1.4 目的意義21-22
• 實驗部分22-57
• 第二章 牛miR-101靶基因的驗證22-40
• 2.1 實驗材料22-23
• 2.1.1 質(zhì)粒、菌株與細胞株22
• 2.1.2 試劑22
• 2.1.3 儀器設(shè)備22-23
• 2.1.4 溶液配制23
• 2.2 實驗方法23-33
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)23
• 2.2.2 模板的提取23-24
• 2.2.3 mi R101PCDH513B1過表達載體和預(yù)測靶基因報告載體構(gòu)建24-27
• 2.2.4 構(gòu)建靶基因MUT-PsiCHECKTM-2 報告載體27-28
• 2.2.5 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染28-29
• 2.2.6 熒光素酶報告系統(tǒng)分析29-30
• 2.2.7 WESTERN BLOT30-33
• 2.3 實驗結(jié)果33-38
• 2.3.1 mi R-101與預(yù)測靶基因 3’UTR結(jié)合位點預(yù)測33
• 2.3.2 mi R101PCDH513B1過表達載體和 3’UTR- PsiCHECKTM-2 載體構(gòu)建33-36
• 2.3.3 熒光素酶報告實驗36-38
• 2.3.4 Western blot檢測miR-101對ING3蛋白表達的影響38
• 2.4 討論38-39
• 2.4.1 過表達載體與報告載體構(gòu)建38
• 2.4.2 驗證mi R-101的直接靶基因38-39
• 2.5 小結(jié)39-40
• 第三章 牛miR-101和靶基因在牛成纖維細胞功能的研究40-49
• 3.1 實驗材料40-41
• 3.1.1 質(zhì)粒和細胞40
• 3.1.2 試劑40
• 3.1.3 儀器設(shè)備40-41
• 3.1.4 溶液配制41
• 3.2 實驗方法41-44
• 3.2.1 細胞的解凍與培養(yǎng)41
• 3.2.2 細胞電轉(zhuǎn)染41
• 3.2.3 細胞篩選41-42
• 3.2.4 陽性細胞中mi R-101過表達檢測42-43
• 3.2.5 mi R-101對靶基因及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響43
• 3.2.6 CCK-8 檢測篩選細胞的增殖曲線43-44
• 3.2.7 流式檢測篩選細胞的凋亡與周期44
• 3.3 實驗結(jié)果44-47
• 3.3.1 陽性細胞的篩選44-45
• 3.3.2 mi R101513-B1過表達效率的檢測45
• 3.3.3 mi R-101對靶基因及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響45-46
• 3.3.4 牛成纖維細胞增殖曲線測定46
• 3.3.5 流式檢測細胞周期與凋亡46-47
• 3.4 討論47-48
• 3.4.1 mi R-101過表達效率檢測47-48
• 3.4.2 mi R-101靶基因及相關(guān)基因mRNA水平表達量檢測48
• 3.4.3 mi R-101對細胞增殖的影響48
• 3.4.4 mi R-101對細胞周期與凋亡的影響48
• 3.5 小結(jié)48-49
• 第四章 miR-101對體細胞核移植胚胎發(fā)育的影響49-57
• 4.1 實驗材料49-51
• 4.1.1 材料49
• 4.1.2 試劑49
• 4.1.3 儀器49
• 4.1.4 溶液配制49-51
• 4.2 實驗方法51-53
• 4.2.1 卵母細胞的采集與體外成熟51
• 4.2.2 體細胞核移植51-52
• 4.2.3 囊胚的凋亡染色52
• 4.2.4 胚胎發(fā)育相關(guān)基因mRNA水平的表達52-53
• 4.3 實驗結(jié)果53-55
• 4.3.1 mi R-101對體細胞核移植胚胎發(fā)育率的影響53
• 4.3.2 mi R-101對體細胞核移植胚胎質(zhì)量的影響53-54
• 4.3.3 mi R-101對核移植胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達的影響54-55
• 4.4 討論55-56
• 4.4.1 mi R-101對體細胞核移植胚胎發(fā)育的影響55
• 4.4.2 mi R-101對體細胞核移植胚胎質(zhì)量的影響55-56
• 4.5 小結(jié)56-57
• 全文結(jié)論57-58
• 創(chuàng)新點和后續(xù)研究58-59
• 參考文獻59-68
• 致謝68-69
• 作者簡介69

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1 洪宗憲;金惠芬;茍三啟;;玉米胚胎發(fā)育研究[J];甘肅農(nóng)業(yè)科技;1983年03期

2 周長海;金斗峰;;鵪鶉胚胎發(fā)育標本的制作方法及應(yīng)用[J];特產(chǎn)研究;1989年03期

3 呂柳新;余小玲;葉明志;肖振通;;荔枝胚胎發(fā)育機制的探討[J];福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報;1989年02期

4 張健,呂柳新,葉明志;荔枝胚胎發(fā)育研究進展[J];福建農(nóng)業(yè)學(xué)報;2001年01期

5 位孟聰;欒正慶;;雞胚胎發(fā)育歌訣[J];中國禽業(yè)導(dǎo)刊;2005年21期

6 童永;沈建忠;;盤麗魚胚胎發(fā)育的研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年07期

7 袁靜;任育軍;趙潔;;水稻胚胎發(fā)育過程相關(guān)基因的鑒定(簡報)(英文)[J];分子細胞生物學(xué)報;2008年03期

8 何登菊;姚俊杰;趙云龍;姜海波;;甌江彩鯉胚胎發(fā)育過程中脂、蛋白及碳水化合物水平的變化[J];動物學(xué)雜志;2011年02期

9 楊國輝;楊自忠;李孟然;王志強;宋宇;;紅瘰疣螈胚胎發(fā)育的初步觀察[J];生物學(xué)通報;2011年08期

10 孔祥會;王書平;江紅霞;聶國興;李學(xué)軍;;金魚胚胎發(fā)育過程中免疫相關(guān)酶活性及丙二醛含量的變化[J];中國水產(chǎn)科學(xué);2011年06期

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1 匡剛橋;梁珂;;神仙魚胚胎發(fā)育研究[A];第三屆全國現(xiàn)代生態(tài)漁業(yè)管理與技術(shù)研究[C];2011年

2 周愛國;馬建波;龍敏明;梁日深;王超;鄒青;陳金濤;鄒記興;;雜交鱧的胚胎發(fā)育及胚后發(fā)育的初步研究[A];2012年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2012年

3 錢耀森;王培亮;鄭小東;楊建敏;李琪;;人工繁育條件下長蛸的生物學(xué)特性及胚胎發(fā)育[A];中國動物學(xué)會、中國海洋湖沼學(xué)會貝類學(xué)會分會第十四次學(xué)會研討會論文摘要匯編[C];2009年

4 洪孝友;朱新平;陳昆慈;潘德博;李凱彬;;美洲鰣胚胎發(fā)育的初步觀察[A];2010年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

5 蔡清潔;何文輝;董占營;李鮮鮮;陳再忠;崔麗香;張奧;;清潔蝦胚胎發(fā)育過程中脂肪酸的變化研究[A];2013年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2013年

6 馮欣璐;姚守秀;米拉;姚秀娟;趙宗勝;;雜交禽、鵪鶉與雞胚胎發(fā)育規(guī)律的形態(tài)學(xué)比較分析[A];中國動物遺傳育種研究進展——第十五次全國動物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2009年

7 吳丹;范晶;楊柳;陳時錦;齊麗娜;梁家充;蔣欽揚;蔣和生;;印記基因與胚胎發(fā)育[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物繁殖學(xué)分會第十五屆學(xué)術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2010年

8 夏建紅;劉靜霞;李志;周莉;桂建芳;;一個新的胚胎發(fā)育調(diào)控基因的表達圖式及其功能研究[A];湖北省遺傳學(xué)會、江西省遺傳學(xué)會2006年學(xué)術(shù)年會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2006年

9 劉靜霞;桂建芳;;銀鯽胎球蛋白B基因的克隆及其在胚胎發(fā)育過程中的表達圖式研究[A];中國的遺傳學(xué)研究——中國遺傳學(xué)會第七次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編[C];2003年

10 姚俊杰;胡先成;趙云龍;段曉偉;安傳光;;羅氏沼蝦胚胎發(fā)育過程中蛋白質(zhì)含量及氨基酸的組成[A];2005年上海市動物學(xué)會學(xué)術(shù)會議論文集[C];2005年

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1 福建農(nóng)林大學(xué) 宣傳部;“荔枝胚胎發(fā)育的生理生化與分子機制研究”出成果[N];福建科技報;2004年

2 陳勇;美發(fā)現(xiàn)影響胚胎發(fā)育新基因[N];光明日報;2005年

3 武安市 繼輝;鵝種蛋咋保存[N];河北農(nóng)民報;2009年

4 劉伯開;鵝種蛋的選擇和保存[N];山西科技報;2004年

5 鄭衛(wèi)軍;影響甲魚卵孵化的因素[N];中國漁業(yè)報;2008年

6 張樂 徐嫣嫣;浙大利用人類胚胎發(fā)育理論尋找攻克癌癥新方法[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報;2001年

7 楊駿 編譯;胚胎發(fā)育過程信號傳遞途徑[N];大眾科技報;2001年

8 記者 胡其峰;蜜蜂胚胎發(fā)育機理研究獲重要突破[N];光明日報;2014年

9 ;著名生物學(xué)家　童第周[N];人民日報;2006年

10 楊玉鳳 李小玲 劉劍霞 胡梟;巧用木箱孵甲魚[N];中國漁業(yè)報;2005年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 蘇廣華;藏羚羊與普氏原羚異種克隆胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2016年

2 盧林杉;miR-291a/b-5p在小鼠著床前胚胎發(fā)育的表達變化及作用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2014年

3 陳偉;荔枝(Litchi chinensis Sonn．)胚胎發(fā)育的生理生化基礎(chǔ)[D];福建農(nóng)林大學(xué);2000年

4 薛璐;人類早期胚胎功能基因組學(xué)研究及胚胎發(fā)育相關(guān)新基因功能初探[D];武漢大學(xué);2010年

5 夏建紅;魚類兩個胚胎發(fā)育調(diào)控基因的表達特征及功能分析[D];中國科學(xué)院研究生院（水生生物研究所）;2007年

6 趙栓;干擾素誘導(dǎo)基因15在牛體外卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育中的作用研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

7 于建寧;5-脫氧雜氮胞苷對小鼠附植前胚胎發(fā)育的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

8 李文蘭;白菜型油菜胚胎發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的研究[D];武漢大學(xué);2011年

9 趙楊;cyclin K在鹵蟲胚胎發(fā)育過程中的分子特征及功能研究[D];浙江大學(xué);2012年

10 蔣f^;G蛋白偶聯(lián)受體激酶在胚胎發(fā)育中調(diào)控作用的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫尉峻;外源谷胱甘肽對牛體外受精胚胎發(fā)育的影響[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 趙男;氟化鈉對中華大蟾蜍胚胎發(fā)育的影響[D];陜西師范大學(xué);2015年

3 張忠杰;家蠶胚胎發(fā)育時期無翅基因Wnt1的功能分析[D];江蘇科技大學(xué);2015年

4 林海軍;胚胎中l(wèi)ncRNA的預(yù)測及其在胚胎發(fā)育過程中的功能分析[D];南昌大學(xué);2015年

5 陳素英;hＭ種普吵媾嚀シ⒂淖饔沒沓醪窖芯縖D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

6 李麒麟;團頭魴胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組分析[D];湖南師范大學(xué);2015年

7 雷翠云;金柑花芽分化和胚胎發(fā)育形態(tài)研究[D];廣西師范大學(xué);2015年

8 陳小嬌;三氯生暴露對胚胎發(fā)育的影響及機制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

9 侯雪寧;暗紋東方渶胚胎發(fā)育相關(guān)miRNA表達差異研究[D];中國海洋大學(xué);2015年

10 謝榮霞;miR-101作用于ING3的功能研究及對牛核移植胚胎發(fā)育的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

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本文編號：763155