本文關(guān)鍵詞：J亞群禽白血病病毒受體作用域鑒定及其在不同品種雞中的比較研究

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【摘要】：J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)所引起的禽類(lèi)造血組織中某些細(xì)胞成分過(guò)度增生的腫瘤性疾病。近些年來(lái),ALV-J在我國(guó)本地雞群中大規(guī)模流行,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程,首先是病毒囊膜蛋白與病毒細(xì)胞受體相互識(shí)別,發(fā)生相互作用,進(jìn)而在受體介導(dǎo)下病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。不同亞群的病毒,其細(xì)胞受體并不相同。據(jù)報(bào)道,禽Ⅰ型Na+/H+交換蛋白(Chicken Na+/H+exchanger typeⅠ,chNHE1)為J亞群禽白血病病毒的細(xì)胞受體。NHE1基因?yàn)榭醇一?廣泛存在于真核動(dòng)物細(xì)胞膜上。在低pH條件下,ALV-J的囊膜蛋白與chNHE1識(shí)別,跨膜區(qū)(Transmembrane,TM)發(fā)生構(gòu)象改變,促使囊膜蛋白與細(xì)胞膜融合,最終病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。病毒與其受體的結(jié)合是病毒進(jìn)入乃至感染過(guò)程的第一步,具有至關(guān)重要的作用。對(duì)于病毒與受體相互作用過(guò)程的研究,有利于探索病毒感染和致病機(jī)制。因而,本研究致力于探索ALV-J的細(xì)胞受體chNHE1的關(guān)鍵作用域及其在不同地方品種雞之間的保守性。首先通過(guò)融合表達(dá)分泌信號(hào)肽的方式實(shí)現(xiàn)了gp85蛋白的高效可溶性表達(dá),進(jìn)而建立了檢測(cè)受體結(jié)合能力的流式細(xì)胞分析方法。同時(shí),構(gòu)建并成功拯救了一株帶有Luciferase標(biāo)記、囊膜蛋白屬于ALV-J的RCAS病毒,并利用此重組病毒建立了檢測(cè)病毒進(jìn)入水平的實(shí)驗(yàn)方法。在此基礎(chǔ)性上,進(jìn)行了chNHE1與人NHE1相應(yīng)膜外環(huán)(Extracellular loop,ECL)及與無(wú)關(guān)標(biāo)簽HA的替換,通過(guò)受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)和病毒進(jìn)入實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)ECL1和ECL3為影響受體功能的關(guān)鍵膜外環(huán)。對(duì)ECL1進(jìn)行逐級(jí)分段替換,證實(shí)了第28-39位氨基酸為影響受體功能的最小區(qū)段。對(duì)這一區(qū)段的12個(gè)氨基酸進(jìn)行了點(diǎn)突變,最終確定30,33,34,38和39五個(gè)位點(diǎn)為影響受體功能的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。與此同時(shí),通過(guò)對(duì)ECL3進(jìn)行分段替換,確定了214/215兩個(gè)位點(diǎn)協(xié)同作用,影響受體結(jié)合能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證所鑒定關(guān)鍵氨基酸的重要作用,以人NHE1為骨架,替換為chNHE1上相應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)及區(qū)段。結(jié)果發(fā)現(xiàn),第28-39區(qū)段能使人NHE1獲得結(jié)合gp85蛋白能力。這一結(jié)果進(jìn)一步證明了28-39位氨基酸是ch NHE1結(jié)合gp85蛋白的關(guān)鍵作用域。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),不同地方品種雞之間ALV-J感染率差異顯著。為了驗(yàn)證這種差異是否是由于chNHE1作用域發(fā)生了變異,本研究從四個(gè)養(yǎng)禽大省選擇了18個(gè)地方品種雞,進(jìn)行了chNHE1作用域的測(cè)序和比對(duì),發(fā)現(xiàn)受體序列完全一致,高度保守。本研究首次鑒定了ALV-J的細(xì)胞受體chNHE1上發(fā)揮作用的關(guān)鍵區(qū)段和位點(diǎn),并發(fā)現(xiàn)受體作用域在不同地方品種雞中高度保守。這些結(jié)果為研究ALV-J感染與致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ),為ALV-J防控策略的制定提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：J亞群禽白血病病毒 作用域 受體 禽Ⅰ型鈉氫交換蛋白
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S858.31
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-18
• 1.1 禽白血病12-13
• 1.1.1 禽白血病概況12
• 1.1.2 禽白血病病毒概況12-13
• 1.2 J亞群禽白血病病毒13-14
• 1.2.1 J亞群禽白血病病毒在我國(guó)的流行過(guò)程13-14
• 1.2.2 J亞群禽白血病病毒的致病性14
• 1.3 病毒受體14-16
• 1.3.1 病毒受體概況14-15
• 1.3.2 禽白血病病毒受體研究進(jìn)展15-16
• 1.4 J亞群禽白血病病毒受體16-17
• 1.4.1 J亞群禽白血病病毒受體的發(fā)現(xiàn)16
• 1.4.2 J亞群禽白血病病毒受體研究進(jìn)展16-17
• 1.5 本研究的目的和意義17-18
• 第二章 RCAS(J)-Luciferase重組病毒拯救與可溶性gp85蛋白的制備18-28
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-19
• 2.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒18
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑18-19
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-23
• 2.2.1 可溶性gp85蛋白的制備19-20
• 2.2.2 流式細(xì)胞技術(shù)20-21
• 2.2.3 RCAS(J)-Luciferase標(biāo)簽病毒的拯救及生物學(xué)功能鑒定21-22
• 2.2.4 受體重建實(shí)驗(yàn)22-23
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-26
• 2.3.1 gp85蛋白的細(xì)胞上清表達(dá)23
• 2.3.2 受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法的建立23-24
• 2.3.3 RCAS(J)-Luciferase標(biāo)簽病毒生物學(xué)功能鑒定結(jié)果24-25
• 2.3.4 病毒進(jìn)入實(shí)驗(yàn)方法的建立25-26
• 2.4. 討論26-27
• 2.5. 小結(jié)27-28
• 第三章 ALV-J受體作用域研究28-38
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料28
• 3.1.1 細(xì)胞與病毒28
• 3.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑28
• 3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器28
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法28-30
• 3.2.1 關(guān)鍵膜外環(huán)的確定28-29
• 3.2.2 最小功能區(qū)段的探索29
• 3.2.3 關(guān)鍵氨基酸的確定29-30
• 3.2.4 功能獲得實(shí)驗(yàn)30
• 3.2.5 HA標(biāo)簽替換查找關(guān)鍵作用域30
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-36
• 3.3.1 ECL1為影響受體功能的關(guān)鍵膜外環(huán)30-32
• 3.3.2 28-39位氨基酸是影響受體結(jié)合能力的最小區(qū)段32
• 3.3.3 影響受體功能的關(guān)鍵氨基酸的確定32-34
• 3.3.4 28-39位氨基酸是使人NHE1獲得受體功能的最小區(qū)段34-35
• 3.3.5 ECL3上 214/215位點(diǎn)協(xié)同作用，，影響受體功能35-36
• 3.4 討論36-37
• 3.5 小結(jié)37-38
• 第四章 不同地方品種雞之間chNHE1作用域序列的比較研究38-45
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料38
• 4.1.1 雞胚與病毒38
• 4.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑38
• 4.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器38
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法38-41
• 4.2.1 不同地方品種雞ALV-J感染率的確定38-39
• 4.2.2 ALV-J受體序列擴(kuò)增與比對(duì)39-41
• 4.2.3 相同雞場(chǎng)不同品種雞病毒進(jìn)入水平的比較41
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-44
• 4.3.1 不同地方品種雞ALV-J感染率存在差異41-42
• 4.3.2 不同地方品種雞chNHE1受體基因序列一致42-43
• 4.3.3 相同雞場(chǎng)不同品種雞病毒進(jìn)入水平?jīng)]有差異43-44
• 4.4 討論44
• 4.5 小結(jié)44-45
• 第五章 全文結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-52
• 附錄52-55
• 致謝55-56
• 作者簡(jiǎn)介56

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1 李子慧;論否定作用域和焦點(diǎn)[D];吉林大學(xué);2016年

2 管曉璐;J亞群禽白血病病毒受體作用域鑒定及其在不同品種雞中的比較研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

本文編號(hào)：760745