本文關鍵詞：J亞群禽白血病病毒受體作用域鑒定及其在不同品種雞中的比較研究

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【摘要】：J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)所引起的禽類造血組織中某些細胞成分過度增生的腫瘤性疾病。近些年來,ALV-J在我國本地雞群中大規(guī)模流行,造成嚴重的經(jīng)濟損失。逆轉錄病毒感染宿主細胞的過程,首先是病毒囊膜蛋白與病毒細胞受體相互識別,發(fā)生相互作用,進而在受體介導下病毒進入宿主細胞。不同亞群的病毒,其細胞受體并不相同。據(jù)報道,禽Ⅰ型Na+/H+交換蛋白(Chicken Na+/H+exchanger typeⅠ,chNHE1)為J亞群禽白血病病毒的細胞受體。NHE1基因為看家基因,廣泛存在于真核動物細胞膜上。在低pH條件下,ALV-J的囊膜蛋白與chNHE1識別,跨膜區(qū)(Transmembrane,TM)發(fā)生構象改變,促使囊膜蛋白與細胞膜融合,最終病毒進入細胞內。病毒與其受體的結合是病毒進入乃至感染過程的第一步,具有至關重要的作用。對于病毒與受體相互作用過程的研究,有利于探索病毒感染和致病機制。因而,本研究致力于探索ALV-J的細胞受體chNHE1的關鍵作用域及其在不同地方品種雞之間的保守性。首先通過融合表達分泌信號肽的方式實現(xiàn)了gp85蛋白的高效可溶性表達,進而建立了檢測受體結合能力的流式細胞分析方法。同時,構建并成功拯救了一株帶有Luciferase標記、囊膜蛋白屬于ALV-J的RCAS病毒,并利用此重組病毒建立了檢測病毒進入水平的實驗方法。在此基礎性上,進行了chNHE1與人NHE1相應膜外環(huán)(Extracellular loop,ECL)及與無關標簽HA的替換,通過受體結合實驗和病毒進入實驗,發(fā)現(xiàn)ECL1和ECL3為影響受體功能的關鍵膜外環(huán)。對ECL1進行逐級分段替換,證實了第28-39位氨基酸為影響受體功能的最小區(qū)段。對這一區(qū)段的12個氨基酸進行了點突變,最終確定30,33,34,38和39五個位點為影響受體功能的關鍵氨基酸位點。與此同時,通過對ECL3進行分段替換,確定了214/215兩個位點協(xié)同作用,影響受體結合能力。為了進一步驗證所鑒定關鍵氨基酸的重要作用,以人NHE1為骨架,替換為chNHE1上相應的氨基酸位點及區(qū)段。結果發(fā)現(xiàn),第28-39區(qū)段能使人NHE1獲得結合gp85蛋白能力。這一結果進一步證明了28-39位氨基酸是ch NHE1結合gp85蛋白的關鍵作用域。流行病學調查發(fā)現(xiàn),不同地方品種雞之間ALV-J感染率差異顯著。為了驗證這種差異是否是由于chNHE1作用域發(fā)生了變異,本研究從四個養(yǎng)禽大省選擇了18個地方品種雞,進行了chNHE1作用域的測序和比對,發(fā)現(xiàn)受體序列完全一致,高度保守。本研究首次鑒定了ALV-J的細胞受體chNHE1上發(fā)揮作用的關鍵區(qū)段和位點,并發(fā)現(xiàn)受體作用域在不同地方品種雞中高度保守。這些結果為研究ALV-J感染與致病機制奠定了基礎,為ALV-J防控策略的制定提供了新思路。
【關鍵詞】：J亞群禽白血病病毒 作用域 受體 禽Ⅰ型鈉氫交換蛋白
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 文獻綜述12-18
• 1.1 禽白血病12-13
• 1.1.1 禽白血病概況12
• 1.1.2 禽白血病病毒概況12-13
• 1.2 J亞群禽白血病病毒13-14
• 1.2.1 J亞群禽白血病病毒在我國的流行過程13-14
• 1.2.2 J亞群禽白血病病毒的致病性14
• 1.3 病毒受體14-16
• 1.3.1 病毒受體概況14-15
• 1.3.2 禽白血病病毒受體研究進展15-16
• 1.4 J亞群禽白血病病毒受體16-17
• 1.4.1 J亞群禽白血病病毒受體的發(fā)現(xiàn)16
• 1.4.2 J亞群禽白血病病毒受體研究進展16-17
• 1.5 本研究的目的和意義17-18
• 第二章 RCAS(J)-Luciferase重組病毒拯救與可溶性gp85蛋白的制備18-28
• 2.1 實驗材料18-19
• 2.1.1 細胞與質粒18
• 2.1.2 主要實驗試劑18-19
• 2.1.3 主要實驗儀器19
• 2.2 實驗方法19-23
• 2.2.1 可溶性gp85蛋白的制備19-20
• 2.2.2 流式細胞技術20-21
• 2.2.3 RCAS(J)-Luciferase標簽病毒的拯救及生物學功能鑒定21-22
• 2.2.4 受體重建實驗22-23
• 2.3 實驗結果23-26
• 2.3.1 gp85蛋白的細胞上清表達23
• 2.3.2 受體結合實驗方法的建立23-24
• 2.3.3 RCAS(J)-Luciferase標簽病毒生物學功能鑒定結果24-25
• 2.3.4 病毒進入實驗方法的建立25-26
• 2.4. 討論26-27
• 2.5. 小結27-28
• 第三章 ALV-J受體作用域研究28-38
• 3.1 實驗材料28
• 3.1.1 細胞與病毒28
• 3.1.2 主要實驗試劑28
• 3.1.3 主要實驗儀器28
• 3.2 實驗方法28-30
• 3.2.1 關鍵膜外環(huán)的確定28-29
• 3.2.2 最小功能區(qū)段的探索29
• 3.2.3 關鍵氨基酸的確定29-30
• 3.2.4 功能獲得實驗30
• 3.2.5 HA標簽替換查找關鍵作用域30
• 3.3 實驗結果30-36
• 3.3.1 ECL1為影響受體功能的關鍵膜外環(huán)30-32
• 3.3.2 28-39位氨基酸是影響受體結合能力的最小區(qū)段32
• 3.3.3 影響受體功能的關鍵氨基酸的確定32-34
• 3.3.4 28-39位氨基酸是使人NHE1獲得受體功能的最小區(qū)段34-35
• 3.3.5 ECL3上 214/215位點協(xié)同作用，，影響受體功能35-36
• 3.4 討論36-37
• 3.5 小結37-38
• 第四章 不同地方品種雞之間chNHE1作用域序列的比較研究38-45
• 4.1 實驗材料38
• 4.1.1 雞胚與病毒38
• 4.1.2 主要實驗試劑38
• 4.1.3 主要實驗儀器38
• 4.2 實驗方法38-41
• 4.2.1 不同地方品種雞ALV-J感染率的確定38-39
• 4.2.2 ALV-J受體序列擴增與比對39-41
• 4.2.3 相同雞場不同品種雞病毒進入水平的比較41
• 4.3 實驗結果41-44
• 4.3.1 不同地方品種雞ALV-J感染率存在差異41-42
• 4.3.2 不同地方品種雞chNHE1受體基因序列一致42-43
• 4.3.3 相同雞場不同品種雞病毒進入水平?jīng)]有差異43-44
• 4.4 討論44
• 4.5 小結44-45
• 第五章 全文結論45-46
• 參考文獻46-52
• 附錄52-55
• 致謝55-56
• 作者簡介56

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1 河北省藁城市麗陽中學 陳會安;動靜兩相宜[N];中國電腦教育報;2006年

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1 李子慧;論否定作用域和焦點[D];吉林大學;2016年

2 管曉璐;J亞群禽白血病病毒受體作用域鑒定及其在不同品種雞中的比較研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2016年

本文編號：760745