本文關(guān)鍵詞：降低溶酶體α-AMA對(duì)SW敏感性的定向改造

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【摘要】：溶酶體α-甘露糖苷酶(lysosomalα-mannosidase,LAM)α-AMA的重要抑制劑苦馬豆素(swainsosine,SW)是一種生物堿,主要來源于瘋草,動(dòng)物采食瘋草后出現(xiàn)和α-甘露糖苷酶貯積癥類似的瘋草病,目前對(duì)瘋草病沒有有效的治療方法。課題組著眼于對(duì)山羊溶酶體α-AMA的研究,以期解決動(dòng)物瘋草中毒的問題,在前期的研究中,孔祥雅等通過RT-PCR方法克隆獲得了敏感動(dòng)物山羊LAM(Capra hircas LAM,chLAM)的基因序列(accession no.JN602369),通過生物信息學(xué)和分子對(duì)接方法對(duì)chLAM的蛋白空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)chLAM由A、B、C、D、E五個(gè)亞基構(gòu)成,A、C、D鏈上的9個(gè)保守的氨基酸位點(diǎn)構(gòu)成其活性中心,并預(yù)測(cè)A28 W/G和D58 Y/G突變型chLAM對(duì)SW的敏感性降低且不影響其對(duì)man5的活性。為驗(yàn)證上述預(yù)測(cè)結(jié)果,本研究用重疊延伸PCR法定點(diǎn)突變A28 W/G和D58 Y/G,并且截去不含活性中心的E肽鏈,將其作為目的基因構(gòu)建畢赤酵母X33重組表達(dá)載體。甲醇誘導(dǎo)重組菌株表達(dá),并分析表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)。結(jié)果如下:1.根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果,設(shè)計(jì)A28 W/G和D58 Y/G定點(diǎn)突變引物,通過重疊延伸PCR方法,獲得A28 W/G和D58 Y/G雙位點(diǎn)突變的目的基因序列:chLAM-A28-D58,再截去其E肽鏈,得到截短雙位點(diǎn)突變基因chT-A28-D58。2.成功構(gòu)建了畢赤酵母X33重組表達(dá)載體pPICZαA-chLAM和pPICZαA-chT-A28-D58,線性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33野生型菌株中,1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后,從酵母細(xì)胞超聲破碎上清中得到全長(zhǎng)基因表達(dá)產(chǎn)物chLAM和截短雙位點(diǎn)突變基因表達(dá)產(chǎn)物chT-A28-D58,大小分別為107 KDa和87 KDa。3.利用pPICZαA載體上的6×His標(biāo)簽對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化,純化各洗脫組分通過8%SDS-PAGE凝膠檢測(cè),在100 mM咪唑濃度洗脫組分中可獲得單一條帶的純化蛋白。對(duì)已純化的chLAM和chT-A28-D58進(jìn)行western blot檢測(cè),PVDF膜在相應(yīng)分子量區(qū)域(107 kDa及87 KDa)可見抗原條帶,即為檢測(cè)的chLAM和chT-A28-D58蛋白條帶。4.chLAM的最適作用溫度和pH分別為55℃和6.0,chT-A28-D58的最適作用溫度和pH則為45℃和6.0。5-10 mM的金屬離子Zn2+、Ca2+、Mg2+、Cr3+對(duì)其活性有促進(jìn)作用,EDTA、Al3+、Co2+對(duì)其活性有抑制作用。加入SW后,chT-A28-D58活性下降42.7%,高于chLAM的活性下降比73.5%。
【關(guān)鍵詞】：溶酶體α-甘露糖苷酶 基因截短 定點(diǎn)突變 畢赤酵母表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.2
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 文獻(xiàn)綜述11-24
• 第一章 Α-甘露糖苷酶研究進(jìn)展11-24
• 1.1 Α-AMA介紹11-15
• 1.1.1 α-AMA基因11-12
• 1.1.1 α-AMA的分類12-13
• 1.1.2 α-AMA的氨基酸序列13-14
• 1.1.2 α-AMA底物特異性14
• 1.1.3 α-AMA基因突變14
• 1.1.4 α-AMA在抗癌藥物的應(yīng)用14
• 1.1.5 α-AMA在其他方面的應(yīng)用14-15
• 1.2 Α-AMA結(jié)構(gòu)研究15-20
• 1.2.1 果蠅溶酶體 α-AMA15
• 1.2.2 釀膿鏈球菌 α-AMA15-19
• 1.2.3 牛溶酶體 α-AMA19-20
• 1.3 Α-AMA酶的改造技術(shù)20-22
• 1.3.1 基因截短技術(shù)研究20-21
• 1.3.2 基因定點(diǎn)突變技術(shù)研究21-22
• 1.4 畢赤酵母表達(dá)22-24
• 試驗(yàn)研究24-45
• 第二章 山羊溶酶體 Α-甘露糖苷酶基因的截短雙突變24-34
• 2.1 材料24-25
• 2.1.1 主要儀器24
• 2.1.2 主要試劑24
• 2.1.3 試驗(yàn)樣品24-25
• 2.1.4 試驗(yàn)菌株及表達(dá)載體25
• 2.1.5 培養(yǎng)基25
• 2.2 方法25-28
• 2.2.1 重疊延伸PCR（overlap extension PCR）引物及截短引物設(shè)計(jì)25-26
• 2.2.2 重疊延伸PCR的反應(yīng)體系26
• 2.2.3 重疊延伸PCR的反應(yīng)步驟26
• 2.2.4 獲取截短片段chT-A28-D5826-27
• 2.2.5 全長(zhǎng)和截短突變 Α-AMA基因的重組酵母表達(dá)載體構(gòu)建27-28
• 2.2.6 Α-AMA基因的畢赤酵母表達(dá)28
• 2.3 結(jié)果28-32
• 2.3.1 雙突變?nèi)L(zhǎng)片段的鑒定28-29
• 2.3.2 全長(zhǎng)雙突變基因的截短29-30
• 2.3.3 全長(zhǎng)和截短雙突變chLAM基因的克隆及測(cè)序30-31
• 2.3.4 重組畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建31
• 2.3.5 重組酵母菌株基因組的PCR31-32
• 2.4 討論32-33
• 2.4.1 表達(dá)載體的構(gòu)建32
• 2.4.2 chLAM基因的定點(diǎn)突變位點(diǎn)選擇32-33
• 2.5 小結(jié)33-34
• 第三章 畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物的鑒定、純化及酶特性的測(cè)定34-45
• 3.1 材料34
• 3.1.1 主要試劑34
• 3.1.2 主要儀器34
• 3.2 方法34-37
• 3.2.1 重組酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)34
• 3.2.2 畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物的樣品處理34-35
• 3.2.3 畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定35
• 3.2.4 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定35
• 3.2.5 畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot鑒定35
• 3.2.6 畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物的純化35
• 3.2.7 表達(dá)產(chǎn)物的酶活測(cè)定35-36
• 3.2.8 表達(dá)產(chǎn)物對(duì)SW敏感性測(cè)定36
• 3.2.9 表達(dá)產(chǎn)物的酶特性分析36-37
• 3.3 結(jié)果37-41
• 3.3.1 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)及純化37
• 3.3.2 表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定37
• 3.3.3 表達(dá)產(chǎn)物的的western blot37-38
• 3.3.4 表達(dá)產(chǎn)物的活性檢測(cè)及其對(duì)SW敏感性的檢測(cè)38-39
• 3.3.5 表達(dá)產(chǎn)物的酶特性分析39-41
• 3.4 討論41-44
• 3.4.1 重組山羊溶酶體 α-AMA對(duì)SW敏感性41-42
• 3.4.2 重組酶的表達(dá)產(chǎn)量42
• 3.4.3 全長(zhǎng)蛋白和截短雙突變蛋白的活性測(cè)定42
• 3.4.4 表達(dá)產(chǎn)物的酶特性分析42-43
• 3.4.5 畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物的鑒定43-44
• 3.5 小結(jié)44-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 致謝50-51
• 作者簡(jiǎn)介51

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