本文關(guān)鍵詞：禽流感病毒H5N1 HA1與雞IgY Fc片段融合蛋白的表達(dá)及粘膜免疫研究

  更多相關(guān)文章： 禽流感病毒H5N1 HA1 FcRy 雞 滴鼻免疫

【摘要】：在過去的幾十年里H5N1型高致病性禽流感(HPAI)不僅給家禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而且對人類的健康也帶來了極大的威脅。此外,H5N1型禽流感病毒常與其他亞型的流感病毒重組,從而導(dǎo)致禽流感的大規(guī)模流行,因此預(yù)防H5N1型禽流感勢在必行。禽流感病毒主要通過呼吸道或消化道等黏膜感染動物,在預(yù)防病原入侵機(jī)體時(shí),滴鼻或者口服接種的途徑與其他免疫途徑相比可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生局部的粘膜免疫和全身性的免疫應(yīng)答,阻止病原微生物入侵機(jī)體抵抗早期的病毒感染。文獻(xiàn)報(bào)道,FcRn可以介導(dǎo)IgG跨越粘膜屏障,雞的FcRy也具有類似的功能,同樣可以與IgY結(jié)合并特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)IgY,本研究將禽流感病毒H5N1的HA1抗原與雞IgY Fc片段融合,將該融合蛋白輔以粘膜佐劑通過滴鼻免疫雞發(fā)現(xiàn)FcRy能介導(dǎo)IgYFc融合蛋白跨越粘膜屏障進(jìn)入體內(nèi),并能有效激發(fā)機(jī)體的局部粘膜免疫和全身性免疫反應(yīng)。所取得的主要結(jié)果如下：1.兔抗雞H5N1 HA1多克隆抗體的制備利用包涵體純化蛋白的方式純化GST-HA1融合蛋白,將該純化蛋白輔以佐劑免疫家兔,制備了兔抗雞H5N1 HA1的高免血清,其ELISA抗體效價(jià)高達(dá)1：16000,Western Blot檢測結(jié)果表明所制備的該多克隆抗體具有良好的特異性。2.pFAST HTb-sHAl-Fc重組質(zhì)粒的構(gòu)建及sHA1-Fc融合蛋白的表達(dá)及純化將H5N1的保護(hù)性抗原sHA1與雞IgY Fc片段融合,構(gòu)建pFAST HTb-sHA1-Fc重組質(zhì)粒,利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)sHA1-Fc融合蛋白并進(jìn)行純化。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,其蛋白大小為82KD,應(yīng)用Western Blot分別對該融合蛋白的sHA1和Fc片段進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示該蛋白已成功表達(dá),在非還原條件下檢測蛋白大小約為160KD,說明該融合蛋白以二聚體的形式存在,具有類似IgY的分子結(jié)構(gòu)。3.禽流感病毒H5N1 HA1融合蛋白跨越呼吸道粘膜屏障的檢測分別將生物素標(biāo)記的sHA1-Fc、GST-HA1融合蛋白和雞IgY通過滴鼻接種雞,8h后檢測雞血清中生物素標(biāo)記蛋白的含量,結(jié)果顯示與GST-HA1融合蛋白(OD450=0.104)相比,sHA1-Fc融合蛋白(OD450=0.384)能更有效的跨越雞呼吸道黏膜上皮屏障轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液中,且二者之間存在顯著性差異(P0.01)。4.禽流感病毒H5N1 HA1融合蛋白粘膜免疫的研究分別將sHA1-Fc和GST-HA1融合蛋白輔以佐劑CpG-ODN 2006滴鼻免疫雞后檢測免疫相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果表明各免疫組均能誘導(dǎo)特異性的粘膜免疫和全身性免疫反應(yīng),而且sHA1-Fc蛋白所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)更強(qiáng)：(1)二免后第14d,sHA1-Fc滴鼻組血清中特異性IgY的ELISA抗體(1：5680)和H1抗體(1：103.97)水平均最高,sHA1-Fc滴鼻組的血清特異性IgY ELISA抗體效價(jià)顯著高于GST-HA1滴鼻組(P0.01),其HI抗體效價(jià)與GST-HA1組相比差異顯著(P0.05)。(2)二免后第10d,在氣管或肺臟沖洗液中,sHA1-Fc滴鼻組特異性SIgA和IgY的ELISA抗體效價(jià)均最高,且與各蛋白免疫組相比差異極顯著(P0.01),與滅活苗組相比差異顯著(P0.05)。(3)二免后第10d,sHA1-Fc滴鼻組IFN-y含量(243.32pg/mL)顯著高于與GST-HA1滴鼻組(P0.01)。sHA1-Fc滴鼻組IL-2含量(341.55pg/mL)顯著高于其他各免疫組(P0.01),各組之間IL-4含量差異不顯著。(4)二免后第10d,sHA1-Fc滴鼻組刺激指數(shù)為2.92,顯著高于GST-HA1滴鼻組和sHA1-Fc皮下注射組(P0.01)。本研究結(jié)果表明FcRy可介導(dǎo)與IgY Fc片段融合的禽流感病毒抗原穿過雞呼吸道粘膜屏障,并能有效的激發(fā)抗禽流感病毒感染的局部粘膜免疫和全身性免疫反應(yīng),為開發(fā)新型禽流感疫苗提供了理論依據(jù)并奠定了良好的基礎(chǔ),為家禽新型粘膜疫苗的研制也提供了一種新的策略。
【關(guān)鍵詞】：禽流感病毒H5N1 HA1 FcRy 雞 滴鼻免疫
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮略語表(Abbreviation)11-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-20
• 1.1 禽流感13-14
• 1.1.1 禽流感病毒13
• 1.1.2 血凝素蛋白(HA)13-14
• 1.1.3 禽流感疫苗的研究進(jìn)展14
• 1.2 哺乳動物新生兒Fc受體(FcRn)的研究進(jìn)展14-15
• 1.2.1 FcRn的分子結(jié)構(gòu)14
• 1.2.2 FcRn的胞轉(zhuǎn)功能14-15
• 1.3 雞卵黃抗體IgY Fc受體(FcRy)的研究進(jìn)展15-16
• 1.3.1 雞卵黃抗體IgY15
• 1.3.2 FcRy的分子結(jié)構(gòu)15-16
• 1.3.3 FcRy與IgY的結(jié)合特點(diǎn)16
• 1.4 桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)16-18
• 1.4.1 桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的基本原理16-17
• 1.4.2 桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢17-18
• 1.5 CpG-ODN18
• 1.6 粘膜免疫18-20
• 2 目的意義20-21
• 3 材料方法21-47
• 3.1 材料21-26
• 3.1.1 菌株、細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動物21
• 3.1.2 質(zhì)粒與桿粒21
• 3.1.3 主要藥品與試劑21
• 3.1.4 主要儀器21-22
• 3.1.5 主要抗生素與培養(yǎng)基的配制22-23
• 3.1.6 主要試劑的配制23-26
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法26-47
• 3.2.1 雞組織RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄26-27
• 3.2.2 引物設(shè)計(jì)27
• 3.2.3 禽流感H5N1 HA1、雞IgY Fc基因的擴(kuò)增27-28
• 3.2.4 sHA1-Fc融合基因的擴(kuò)增28-29
• 3.2.5 重組質(zhì)粒pMD18-T-sHA1-Fc的構(gòu)建29-30
• 3.2.6 pFAST HTb-sHA1-Fc重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座30-31
• 3.2.7 桿粒Bacmid的提取與鑒定31-33
• 3.2.8 重組陽性桿粒Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞33-34
• 3.2.9 桿狀病毒的擴(kuò)增34-36
• 3.2.10 重組sHA1-Fc融合蛋白的表達(dá)36
• 3.2.11 GST-HA1融合蛋白的大量表達(dá)與純化36-37
• 3.2.12 抗禽流感病毒H5N1 HA1多克隆抗體的制備37-41
• 3.2.13 非還原條件下sHA1-Fc融合蛋白Western Blot檢測41-42
• 3.2.14 HA1融合蛋白跨越雞呼吸道粘膜屏障的檢測42-43
• 3.2.15 滴鼻和皮下接種雞的免疫效果檢測43-47
• 4 結(jié)果47-61
• 4.1 禽流感H5N1 HA1、雞IgY Fc基因的擴(kuò)增47
• 4.2 sHA1-Fc融合基因的擴(kuò)增47-48
• 4.3 重組質(zhì)粒pMD18-T-sHA1-Fc的構(gòu)建48
• 4.4 pFAST HTb-sHA1-Fc真核表達(dá)載體的構(gòu)建48-49
• 4.5 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座49-50
• 4.6 重組陽性桿粒Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞50-51
• 4.7 重組sHA1-Fc融合蛋白的表達(dá)51
• 4.8 GST-HA1融合蛋白的大量表達(dá)與純化51-52
• 4.9 抗禽流感病毒H5N1 HA1多克隆抗體的制備52-53
• 4.10 重組sHA1-Fc融合蛋白的表達(dá)53
• 4.11 重組sHA1-Fc融合蛋白的純化與鑒定53-54
• 4.12 非還原條件下sHA1-Fc融合蛋白Western Blot檢測54-55
• 4.13 HA1融合蛋白跨越雞呼吸道粘膜屏障的檢測55
• 4.14 融合蛋白接種雞的免疫效果檢測55-61
• 4.14.1 血清中抗禽流感H5N1 HA1特異性抗體IgY的檢測55-56
• 4.14.2 血清特異性抗體的HI效價(jià)檢測56-57
• 4.14.3 呼吸道局部特異性IgY和SIgA的檢測57-59
• 4.14.4 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)59
• 4.14.5 血清中細(xì)胞因子的檢測59-61
• 5 討論61-64
• 5.1 引物設(shè)計(jì)61
• 5.2 HA1融合蛋白跨越呼吸道粘膜屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)61
• 5.3 融合蛋白的粘膜免疫61-64
• 6 結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-72

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王璋瑜;;蛋白設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室公司買下融合蛋白技術(shù)實(shí)用權(quán)[J];生物技術(shù)通報(bào);1990年10期

2 張毅,屈賢銘,楊勝利;融合蛋白基因工程應(yīng)用及研究[J];生物工程進(jìn)展;2000年03期

3 楊林,李國清,黃葆英,王全忠,龍綮新,王s閼，

本文編號：759209