本文關(guān)鍵詞：重組A型FMDV VP1基因減毒沙門菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其黏膜免疫效果

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【摘要】：【目的】口蹄疫(foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一種具有極高傳染性和暴發(fā)性的偶蹄動物疫病,可導(dǎo)致患病動物蹄部、口舌及乳房水泡性病變并伴隨發(fā)熱和腫痛的癥狀。該病可造成家畜生產(chǎn)性能降低以及幼畜極高的致死率,對流行地區(qū)的畜牧業(yè)及畜產(chǎn)品貿(mào)易造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,因而被世界公認(rèn)為最重要的高度傳染性的偶蹄動物疫病之一。本試驗(yàn)通過構(gòu)建重組A型FMDV VP1基因減毒鼠傷寒沙門菌,誘導(dǎo)產(chǎn)生外源蛋白,為減毒鼠傷寒沙門菌作為FMDV VP1口服活載體疫苗可行性提供研究基礎(chǔ)。【方法】(1)將A型FMDV VP1基因克隆后測序,根據(jù)減毒鼠傷寒沙門菌的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化,再將其插入表達(dá)載體p YA3341之中,將重組質(zhì)粒p YA3341-VP1采用化學(xué)法轉(zhuǎn)入大腸桿菌X6212中,篩選陽性克隆。經(jīng)PCR與雙酶切鑒定正確后,將重組質(zhì)粒p YA3341-VP1依次轉(zhuǎn)入減毒鼠傷寒沙門菌中間宿主X3730和表達(dá)宿主X4550中,在轉(zhuǎn)入X4550后第3.5h加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE與Western-blot分析。(2)將上述重組減毒沙門菌經(jīng)BALB/c小鼠口服免疫2次后于0d、24d、42d、56d采血,進(jìn)行ELISA抗體檢測�！窘Y(jié)果】(1)成功構(gòu)建了重組減毒沙門菌X4550-VP1載體,且表達(dá)產(chǎn)物大小為23ku,與預(yù)期目的蛋白大小相符,表明FMDV VP1基因在減毒鼠傷寒沙門菌中得到了成功表達(dá)。(2)小鼠黏膜免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明血清Ig G較對照組有所升高,PBS對照組與空載體對照組差異不明顯,但與滅活疫苗組相比,抗體水平并不理想;血清Ig A相對Ig G水平較低且消失較快。經(jīng)兩次免疫后小鼠的黏膜部位均產(chǎn)生了分泌型s Ig A,證明重組減毒沙門菌在小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答并產(chǎn)生一定的抗體水平,而PBS對照組s Ig A沒有顯著差異,空載體對照組s Ig A有所上升,可能由于減毒沙門菌誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生極微弱的黏膜免疫反應(yīng)所致,提示減毒沙門菌在表達(dá)外源蛋白的同時自身也可以發(fā)揮免疫佐劑的效用,但相關(guān)研究結(jié)果還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。血清中和抗體檢測表明,重組菌還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生一定水平的中和抗體。【結(jié)論】本研究以構(gòu)建的減毒沙門菌作為載體遞呈外源蛋白,通過口服方式用其對小鼠進(jìn)行免疫后,不僅可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定水平的針對外源蛋白的血清抗體,還可激發(fā)機(jī)體局部的黏膜免疫反應(yīng)。雖然產(chǎn)生的抗體水平較滅活完整病毒的疫苗低,但其所具有的可通過口服方式誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng)、不易散毒安全性高、生產(chǎn)成本較低和具有佐劑效應(yīng)等優(yōu)勢,使其成為擁有較強(qiáng)競爭力的口蹄疫活載體疫苗候選株。
【關(guān)鍵詞】：口蹄疫病毒 VP1蛋白 減毒鼠傷寒沙門菌 活載體疫苗 黏膜免疫
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 摘要3-4
• Summary4-10
• 第一章 緒論10-21
• 1.1 口蹄疫概述10-11
• 1.1.1 口蹄疫病毒的研究現(xiàn)狀10-11
• 1.1.2 口蹄疫病毒基因組的結(jié)構(gòu)及功能11
• 1.2 口蹄疫疫苗的研究進(jìn)展11-15
• 1.2.1 傳統(tǒng)疫苗12
• 1.2.2 核酸疫苗12
• 1.2.3 合成肽疫苗12-13
• 1.2.4 亞單位疫苗13
• 1.2.5 活載體疫苗13-14
• 1.2.6 新型減毒疫苗14-15
• 1.3 減毒沙門菌與黏膜免疫15-19
• 1.3.1 黏膜免疫概述15-16
• 1.3.2 沙門菌的生物學(xué)特性及其減毒類型16-17
• 1.3.3 沙門菌侵染機(jī)制17-18
• 1.3.3.1 沙門菌相關(guān)毒力島及液泡的生物合成18
• 1.3.3.2 沙門菌與宿主產(chǎn)生的應(yīng)答反應(yīng)與存活策略18
• 1.3.3.3 上皮細(xì)胞途徑與非上皮細(xì)胞途徑18
• 1.3.4 減毒沙門菌作為活載體疫苗的優(yōu)勢18-19
• 1.4 研究目的及意義19
• 1.5 研究內(nèi)容及方法19-21
• 1.5.1 A型FMDV VP1基因擴(kuò)增及優(yōu)化合成及在減毒沙門菌中的表達(dá)19
• 1.5.2 重組減毒沙門菌X4550（pYA3341-VP1）黏膜免疫效果分析19-20
• 1.5.3 技術(shù)路線20-21
• 第二章 重組A型FMDV VP1基因減毒沙門菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)21-35
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 毒株、菌株及質(zhì)粒21
• 2.1.2 主要試劑及工具酶21-22
• 2.1.3 主要儀器及設(shè)備22
• 2.1.4 試劑配制22-23
• 2.2 方法23-29
• 2.2.1 PCR引物設(shè)計與合成23
• 2.2.2 目的基因VP1的優(yōu)化合成23
• 2.2.3 pUC57-simple-VP1質(zhì)粒提取23-24
• 2.2.4 pYA3341質(zhì)粒提取24
• 2.2.5 目的基因VP1與表達(dá)載體pYA3341雙酶切片段的回收24-25
• 2.2.6 目的片段VP1與質(zhì)粒pYA3341的連接25
• 2.2.7 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化25-26
• 2.2.7.1 感受態(tài)細(xì)胞X6212的制備25-26
• 2.2.7.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化X621226
• 2.2.8 陽性質(zhì)粒pYA3341-VP1的提取及鑒定26-27
• 2.2.9 在中間宿主x3730和終末宿主x4550中的轉(zhuǎn)化27-28
• 2.2.9.1 感受態(tài)細(xì)胞X3730和X4550的制備27
• 2.2.9.2 pYA3341-VP1依次電轉(zhuǎn)化X3730和X455027-28
• 2.2.10 重組菌X4550（pYA3341-VP1）生長曲線測定28
• 2.2.11 重組pYA3341-VP1在X4550中的表達(dá)及鑒定28-29
• 2.2.11.1 重組pYA3341-VP1在X4550中的誘導(dǎo)表達(dá)28
• 2.2.11.2 重組菌X4550（pYA3341-VP1） 的SDS-PAGE分析28-29
• 2.2.11.3 重組菌X4550（pYA3341-VP1） Western-blot分析29
• 2.3 結(jié)果與分析29-33
• 2.3.1 PCR擴(kuò)增目的片段VP129
• 2.3.2 目的基因VP1序列的分析及優(yōu)化29-30
• 2.3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pYA3341-VP1在X6212中的鑒定30
• 2.3.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pYA3341-VP1在X3730和X4550中的鑒定30-31
• 2.3.5 重組菌生長狀況分析31
• 2.3.6 重組減毒沙門菌X4550（pYA3341-VP1）表達(dá)外源蛋白分析31-32
• 2.3.7 重組減毒沙門菌X4440（pYA3341-VP1）Western-blot鑒定結(jié)果32-33
• 2.4 討論33-35
• 第三章 重組沙門菌X4550（pYA3341-VP1）對小鼠黏膜免疫試驗(yàn)35-42
• 3.1 材料35-36
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動物35
• 3.1.2 主要設(shè)備及試驗(yàn)儀器35
• 3.1.3 主要試劑35
• 3.1.4 菌株及質(zhì)粒35
• 3.1.5 試劑配制35-36
• 3.2 動物免疫試驗(yàn)36-38
• 3.2.1 重組減毒沙門菌X4550（pYA3341-VP1）與減毒沙門菌X4550（pYA3341）的制備36
• 3.2.2 試驗(yàn)小鼠分組36
• 3.2.3 小鼠黏膜樣品的收集及處理36-37
• 3.2.4 免疫小鼠的血清收集37
• 3.2.5 小鼠黏膜樣品sIgA的檢測37
• 3.2.6 小鼠血清中IgA、IgG的檢測37-38
• 3.2.7 小鼠中和抗體測定38
• 3.3 結(jié)果38-40
• 3.3.1 免疫小鼠黏膜樣品sIgA的檢測結(jié)果38-39
• 3.3.2 免疫小鼠血液中IgG、IgA的檢測結(jié)果39-40
• 3.3.3 小鼠中和抗體測定結(jié)果分40
• 3.4 討論40-42
• 全文結(jié)論42-43
• 致謝43-44
• 參考文獻(xiàn)44-50
• 附錄50-51
• 作者簡歷51-52
• 導(dǎo)師簡介52-53

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李婧靜;重組A型FMDV VP1基因減毒沙門菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其黏膜免疫效果[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

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本文編號：758868