發(fā)布時(shí)間：2017-08-30 07:37

  本文關(guān)鍵詞：MEF2C低表達(dá)對(duì)成肌細(xì)胞C2C12肌纖維組成的影響及分子作用機(jī)制的初步探討

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【摘要】：目的通過(guò)建立MEF2C基因低表達(dá)的小鼠成肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞株,利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot技術(shù)分析MEF2C基因低表達(dá)后肌纖維和四個(gè)信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)情況,為進(jìn)一步闡明MEF2C基因表達(dá)對(duì)肌纖維組成及相關(guān)信號(hào)通路影響的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法本研究采用RNAi技術(shù),設(shè)計(jì)并合成3條針對(duì)豬MEF2C基因的RNA干擾序列,構(gòu)建RNA干擾載體(shRNA),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細(xì)胞,用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中MEF2C mRNA和蛋白的表達(dá)情況,選擇高效特異shRNA序列;將干擾效率最佳的shRNA重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞中,獲得3個(gè)MEF2C低表達(dá)混合細(xì)胞克隆株;采用實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)低表達(dá)細(xì)胞株中MEF2C、CFL2、肌纖維組成成分(MLC、α-actin、MyHC slow、MyHC 2a、MyHC 2x和MyHC 2b)和信號(hào)通路關(guān)鍵分子(CaM、p38、AMPKα2、RhoA和skMLCK)的mRNA和蛋白表達(dá)水平,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果1、成功構(gòu)建針對(duì)豬MEF2C基因3個(gè)不同的干擾重組載體(shRNA)。shRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞后,MEF2C mRNA抑制率分別為67.09%±5.68%、59.70%±5.21%、68.80%±5.78%;MEF2C蛋白抑制率分別為19.33%±1.62%、17.58%±2.80%和43.81%±0.20%,因此第三條shRNA干擾MEF2C表達(dá)效果最好。2、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明:與空白對(duì)照組相比,肌纖維成分中α-actin、MyHC slow、MyHC 2x、MyHC 2b顯著或極顯著提高(p0.05或p0.01),MLC、MyHC 2a極顯著降低(p0.01);信號(hào)通路關(guān)鍵分子中CaM、p38、AMPKα2、RhoA顯著或極顯著降低(p0.05或p0.01),各組的skMLCK表達(dá)均不顯著(p0.05);CFL2各組呈顯著或極顯著降低(p0.05或p0.01)。3、Western blot檢測(cè)結(jié)果表明:與空白對(duì)照組相比,肌纖維成分中MLC、MyHC slow、MyHC 2a極顯著降低(p0.01),而α-actin、MyHC 2x、MyHC 2b顯著或極顯著升高(p0.05或p0.01);信號(hào)通路關(guān)鍵分子中,p38顯著升高(p0.05),其他四種成分(CaM、AMPKα2、RhoA、skMLCK)差異不顯著(p0.05);CFL2顯著或極顯著升高(p0.05或p0.01)。4、建立了MEF2C與p38、CFL2和MyHC 2b相關(guān)關(guān)系的數(shù)學(xué)模型。統(tǒng)計(jì)分析表明,本實(shí)驗(yàn)所涉及基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)并不一致,說(shuō)明由mRNA至蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程是C2C12細(xì)胞株基因表達(dá)的關(guān)鍵過(guò)程。5、結(jié)果表明,MEF2C mRNA與其蛋白呈極顯著正相關(guān)(p0.01),相關(guān)系數(shù)為0.985,與CFL2蛋白呈極顯著負(fù)相關(guān)(p0.01),相關(guān)系數(shù)為0.962;AMPKα2、CaM和p38 mRNA表達(dá)與MEF2C的蛋白表達(dá)呈顯著或極顯著正相關(guān)(p0.05或p0.01);其余各基因的mRNA與蛋白之間同樣存在顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系。結(jié)論C2C12細(xì)胞中MEF2C低表達(dá)使肌纖維成分MLC和MyHC 2a的表達(dá)量降低,而α-actin、MyHC 2b和MyHC 2x升高,說(shuō)明MEF2C表達(dá)量影響肌纖維組成成分;MEF2C的低表達(dá)對(duì)肌纖維的影響機(jī)制可能涉及AMPK、CaM、MAPK和Rho四個(gè)信號(hào)通路。
【關(guān)鍵詞】：MEF2C 低表達(dá) 肌纖維 信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.2
【目錄】：

• 中文論著摘要4-6
• 英文論著摘要6-9
• 英文縮略語(yǔ)表9-11
• 前言11-12
• 實(shí)驗(yàn)材料與方法12-24
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-48
• 討論48-54
• 結(jié)論54-55
• 本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 附錄60-76
• 一、文獻(xiàn)綜述 MEF2C基因的研究進(jìn)展60-72
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 二、在學(xué)期間科研成績(jī)72-73
• 三、致謝73-75
• 四、個(gè)人簡(jiǎn)介75-76

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本文編號(hào)：758050