本文關(guān)鍵詞：小反芻獸疫及水泡性口炎病毒N蛋白表達(dá)及應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 小反芻獸疫病毒 水泡性口炎病毒 原核表達(dá) 間接ELISA 單克隆抗體

【摘要】：小反芻獸疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起的以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為主要特征的一種急性傳染病,PPRV基因組為有囊膜的多形性單股無節(jié)段負(fù)鏈RNA,編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(N、M、 P、L、F和H蛋白),其中N蛋白是PRRV核衣殼蛋白,也是主要結(jié)構(gòu)蛋白,是PPRV抗原性最穩(wěn)定、含量最高的蛋白,動(dòng)物感染PPRV后可迅速產(chǎn)生針對N蛋白的高滴度抗體,雖然該抗體不具有中和病毒的活性,但抗體維持時(shí)間較長。水泡性口炎(Vesicular Stomatitis, VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)引起多種動(dòng)物感染易感的以舌、唇、口腔黏膜、乳頭和蹄冠等處上皮發(fā)生水泡樣病變?yōu)橹饕卣鞯囊环N急性、高度接觸性傳染病,VSV基因組為線狀單股負(fù)鏈RNA,從3”到5'端依次編碼了N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白,其中其中N蛋白能保護(hù)病毒免受核糖核酸酶的降解,在病毒的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程中起著很關(guān)鍵的作用,且N蛋白具有高度保守性,VSV所有型之間均具有交叉保護(hù)性。鑒于此,本研究對PPRV和VSV N蛋白進(jìn)行了原核表達(dá),并對表達(dá)的蛋白進(jìn)行了應(yīng)用,即利用純化后的PPRV N蛋白建立了PPRV間接ELISA抗體檢測方法；利用純化后的VSV N蛋白制備了VSV單克隆抗體。旨在為PPRV的臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、疫苗免疫效果監(jiān)測等提供一種簡單、快速、敏感、特異的血清學(xué)診斷方法；為VSV發(fā)病機(jī)理研究和VSV抗原診斷試劑的研制奠定基礎(chǔ)。參照GenBank中已發(fā)表的PPRV基因組N基因序列,設(shè)計(jì)合成1對特異性引物,RT-PCR擴(kuò)增了長約1500 bp的N基因片段,將目的片段亞克隆至pCold I原核表達(dá)載體中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組N蛋白的表達(dá),重組蛋白經(jīng)親和層析法純化后,Western-Blotting檢測證明具有重組蛋白良好的免疫原性。以重組N蛋白為包被抗原,經(jīng)間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了檢測PPRV抗體的間接ELISA診斷方法,該方法檢測口蹄疫病毒、羊痘病毒、偽狂犬病毒陽性血清均為陰性；該方法重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于10%;該方法與進(jìn)口小反芻獸疫血清抗體檢測試劑盒的符合率為達(dá)98.3%。參照GenBank中已發(fā)表的VSV基因組N基因序列,分別合成VSV不同血清型的N基因,經(jīng)序列對比分析后,設(shè)計(jì)合成1對特異性引物,PCR擴(kuò)增了長約1200 bp的N基因片段,將目的片段亞克隆至pCold I原核表達(dá)載體中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組N蛋白的表達(dá),重組蛋白經(jīng)親和層析法純化后,Western-Blotting檢測證明具有重組蛋白良好的反應(yīng)性。以重組N蛋白為免疫原免疫6周齡BALB/c雌鼠,取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合,經(jīng)間接ELISA篩選獲得了3株穩(wěn)定分泌VSV特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株,間接免疫熒光試驗(yàn)表明3株單克隆抗體均可與VSV發(fā)生特異性反應(yīng)。綜上,本研究利用原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)的PPRV N蛋白具有良好反應(yīng)活性,以純化的重組N蛋白為包被抗原建立的PPRV間接ELISA抗體監(jiān)測方法具有良好的敏感性、特異性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性,為PPRV抗體檢測、臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及疫苗免疫效果監(jiān)測等提供了一種簡便、快速、高通量的血清學(xué)檢測方法。利用原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)的VSV N蛋白具有良好的免疫原性,以純化的重組N蛋白為免疫原,制備的3株抗VSV單克隆抗體具有良好的免疫原性,為建立以單克隆抗體為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測試劑盒的研制與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：小反芻獸疫病毒 水泡性口炎病毒 原核表達(dá) 間接ELISA 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S855.3
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 引言13-14
• 1 文獻(xiàn)綜述14-24
• 1.1 小反芻獸疫14-16
• 1.1.1 小反芻獸疫概述14
• 1.1.2 小反芻獸疫臨床癥狀14
• 1.1.3 流行病學(xué)14-15
• 1.1.4 小反芻獸疫的診斷15
• 1.1.5 小反芻獸疫預(yù)防措施15-16
• 1.2 小反芻獸病毒16-18
• 1.2.1 病毒形態(tài)特征16
• 1.2.2 病毒的理化特征16
• 1.2.3 病毒的血凝性16
• 1.2.4 病毒的結(jié)構(gòu)16-18
• 1.3 水泡性口炎18-20
• 1.3.1 水泡性口炎概述18
• 1.3.2 臨床癥狀18-19
• 1.3.3 水泡性口炎的流行病學(xué)19
• 1.3.4 水泡性口炎的診斷19-20
• 1.3.5 防制措施20
• 1.4 水泡性口炎病毒20-22
• 1.4.1 水泡性口炎病毒概述20
• 1.4.2 VSV的基因組結(jié)構(gòu)20-21
• 1.4.3 VSV N基因21-22
• 1.4.4 VSV對宿主細(xì)胞的影響22
• 1.5 研究目的、意義和內(nèi)容22-24
• 1.5.1 研究目的意義22
• 1.5.2 研究方法及內(nèi)容22-24
• 2 小反芻獸疫N蛋白的原核表達(dá)及免疫原性分析24-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑24-25
• 2.1.1 菌毒株、載體24
• 2.1.2 主要試劑及工具酶24
• 2.1.3 培養(yǎng)基24-25
• 2.1.4 溶液25
• 2.1.5 儀器與設(shè)備25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-30
• 2.2.1 病毒RNA的提取25-26
• 2.2.2 RT-PCR擴(kuò)增目的片段26-27
• 2.2.3 目的基因克隆27-29
• 2.2.4 N基因的序列測定與分析29
• 2.2.5 PPRV分子特征分析29
• 2.2.6 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化29
• 2.2.7 SDS-PAGE分析29
• 2.2.8 重組目的蛋白的純化29-30
• 2.2.9 Western blot鑒定分析30
• 2.3 結(jié)果30-34
• 2.3.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果30
• 2.3.2 N基因序列分析結(jié)果30-31
• 2.3.3 PPRV N蛋白二級結(jié)構(gòu)分析31-32
• 2.3.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定32
• 2.3.5 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果32
• 2.3.6 N基因的誘導(dǎo)表達(dá)及純化32-33
• 2.3.7 N蛋白Western-Blotting免疫活性分析33-34
• 2.4 討論34
• 2.5 小結(jié)34-35
• 3 小反芻獸疫N蛋白間接ELISA方法的建立35-42
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料35
• 3.1.1 主要試劑和血清35
• 3.1.2 主要儀器與設(shè)備35
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法35-37
• 3.2.1 抗原最佳包被度和血清最佳稀釋度的確定35
• 3.2.2 抗原最佳包被條件的確定35-36
• 3.2.3 最佳二抗工作濃度的確定36
• 3.2.4 ELISA方法初步建立36
• 3.2.5 ELISA臨界值的確定36
• 3.2.6 特異性試驗(yàn)36-37
• 3.2.7 敏感性試驗(yàn)37
• 3.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)37
• 3.2.9 對比試驗(yàn)37
• 3.3 結(jié)果37-40
• 3.3.1 最佳工作濃度37-38
• 3.3.2 抗原最佳包被條件38
• 3.3.3 臨界值的確定38-39
• 3.3.4 特異性試驗(yàn)39
• 3.3.5 敏感性試驗(yàn)39
• 3.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)39-40
• 3.3.7 對比試驗(yàn)40
• 3.4 討論40-41
• 3.5 小結(jié)41-42
• 4 VSV-IND型和VSV-NJ型的N基因克隆及原核表達(dá)42-50
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料試劑42
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法42-43
• 4.2.1 基因的合成42
• 4.2.2 表達(dá)引物的設(shè)計(jì)與合成42
• 4.2.3 目的基因擴(kuò)增及原核表達(dá)載體的構(gòu)建42-43
• 4.2.4 基因序列及其同源性分析43
• 4.2.5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)43
• 4.2.6 SDS-PAGE分析43
• 4.2.7 Western bolt鑒定分析43
• 4.2.8 VSV N蛋白的純化43
• 4.3 結(jié)果43-48
• 4.3.1 序列分析43
• 4.3.2 N基因的理化性質(zhì)43-44
• 4.3.3 N基因酶切鑒定44-45
• 4.3.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定45-46
• 4.3.5 N基因表達(dá)及蛋白純化46-47
• 4.3.6 N蛋白Western-Blotting免疫活性分析47-48
• 4.4 討論48-49
• 4.5 小結(jié)49-50
• 5 VSV N基因單克隆抗體的制備和特性分析50-56
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑50
• 5.1.1 主要試劑50
• 5.1.2 儀器設(shè)備50
• 5.1.3 動(dòng)物和細(xì)胞株50
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法50-52
• 5.2.1 抗原的制備50-51
• 5.2.2 動(dòng)物免疫51
• 5.2.3 間接ELISA檢測方法的建立51
• 5.2.4 細(xì)胞融合與陽性克隆篩選51
• 5.2.5 腹水制備及單克隆抗體純化51-52
• 5.2.6 單克隆抗體的滴度測定52
• 5.2.7 間接熒光抗體試驗(yàn)52
• 5.3 結(jié)果52-54
• 5.3.1 細(xì)胞融合及篩選結(jié)果52
• 5.3.2 腹水的制備及單克隆抗體純化52-53
• 5.3.3 單克隆抗體滴度53
• 5.3.4 間接免疫熒光試驗(yàn)53-54
• 5.4 討論54-55
• 5.5 小結(jié)55-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-65
• 附錄1 PPRV-N核苷酸及氨基酸序列65-66
• 附錄2 VSV-IDN-N核苷酸及氨基酸序列66-68
• 附錄3 VSV-NJ-N核苷酸及氨基酸序列68-70
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況70-71
• 致謝71-72

【參考文獻(xiàn)】

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