發(fā)布時(shí)間：2017-08-28 03:07

  本文關(guān)鍵詞：抗沙門氏菌PEG菌毛單克隆抗體的研制及初步臨床應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 沙門氏菌 菌毛 pegA 原核表達(dá) 單克隆抗體 玻板凝集

【摘要】：沙門氏菌廣泛分布在自然界中,為革蘭氏陰性菌,是腸桿菌科屬中重要的人畜共患病原菌。目前已確認(rèn)的沙門氏菌血清型高達(dá)2600多種。在畜禽生產(chǎn)養(yǎng)殖中,沙門氏菌污染一直是不可忽視的問題,其中腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)和雞-雛沙門氏菌(S.gallinarum-pullorum)是禽類養(yǎng)殖中沙門氏菌污染的常見血清型,可引起產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能下降、肉雞逐漸消瘦和雛雞大量死亡等危害,對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本文研究D群沙門氏菌中腸炎沙門氏菌和雞-雛沙門氏菌特異表達(dá)的PEG菌毛,通過PCR擴(kuò)增該菌毛主要亞單位pegA基因,構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)并制備PEG菌毛單克隆抗體,利用玻板凝集方法快速檢測腸炎沙門氏菌和雞-雛沙門氏菌,為判斷禽沙門氏菌污染提供依據(jù)。本文分三部分進(jìn)行研究論述：研究一：沙門氏菌PEG菌毛主要亞單位基因pegA的原核表達(dá)。根據(jù)GenBank中PEG菌毛的全基因序列,設(shè)計(jì)一對針對菌毛主要亞單位pegA的特異性引物,以雞白痢沙門氏菌CVCC 526基因組為模板,利用PCR擴(kuò)增技術(shù)大量獲得pegA目的基因�；蚱慰寺∪雙MD19-T載體,測序結(jié)果表明序列大小為531 bp,符合預(yù)計(jì)大小且序列未突變。為制備并純化重組蛋白,將pegA基因片段克隆入帶有HIS標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET-22b (+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b (+)-pegA。將篩選好的重組質(zhì)粒pET-22b (+)-pegA轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得大小約為23 KDa的可溶性蛋白。表達(dá)的重組蛋白經(jīng)鎳柱試劑盒純化后,獲得濃度約0.83 mg/mL的純化重組蛋白,命名為rPegA。通過SDS-PAGE和Western blot分析蛋白條帶大小和反應(yīng)特異性,確定制備的融合蛋白為預(yù)期目的蛋白。研究二：抗沙門氏菌PEG菌毛單克隆抗體的制備。將表達(dá)的重組蛋白免疫BALB/c小鼠,應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),在細(xì)胞融合和三次亞克隆篩選后獲得3株穩(wěn)定分泌的單克隆雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1D10,3D12和484。這三株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)液氮凍存后復(fù)蘇,連續(xù)傳代后效價(jià)未降低,穩(wěn)定性良好。間接ELISA方法測定單抗腹水效價(jià)3D12為1：64000。Western blot檢測結(jié)果表明制備的單克隆抗體均能特異性的與重組蛋白、腸炎沙門氏菌CMCC50336,雞白痢沙門氏菌CVCC526和雞傷寒沙門氏菌T63發(fā)生反應(yīng),而與鼠傷寒沙門氏菌T14和大腸桿菌DH5a均不發(fā)生反應(yīng)。玻板凝集試驗(yàn)結(jié)果表明,單抗腹水可以與腸炎沙門氏菌50336,雞白痢沙門氏菌CVCC 526和雞傷寒沙門氏菌T63凝集成陽性反應(yīng),而與鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌DH5a不產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。說明本試驗(yàn)制備的PEG菌毛單克隆抗體具有良好的特異性。研究三：沙門氏菌PEG菌毛單克隆抗體的初步臨床應(yīng)用。以PEG菌毛單克隆抗體建立玻板凝集方法,若玻板凝集試驗(yàn)呈陽性,表明被檢菌液中含有腸炎沙門氏菌和／或雞-雛沙門氏菌,反之則無。PEG菌毛單克隆抗體作為檢測抗體,玻板凝集方法檢測本實(shí)驗(yàn)室分離保存的72份沙門氏菌樣本,共檢測出43份陽性樣品；沙門氏菌診斷血清作為平行對照,共檢測出45份雞-雛沙門氏菌和腸炎沙門氏菌陽性樣品。沙門氏菌診斷血清和PEG單克隆抗體玻板凝集結(jié)果符合率為95.6%(43/45)。本試驗(yàn)研制的沙門氏菌PEG菌毛單克隆抗體介導(dǎo)的玻板凝集方法,對禽養(yǎng)殖業(yè)中腸炎沙門氏菌和雞-雛沙門氏菌的檢測和凈化有潛在應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：沙門氏菌 菌毛 pegA 原核表達(dá) 單克隆抗體 玻板凝集
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 符號說明10-11
• 文獻(xiàn)綜述11-30
• 綜述一 沙門氏菌PEG菌毛研究進(jìn)展11-15
• 1 PEG菌毛基因進(jìn)化和推進(jìn)蛋白分類11-12
• 2 PEG菌毛的分子生物學(xué)特征12-13
• 3 PEG菌毛的表達(dá)13-14
• 4 PEG菌毛在致病性中發(fā)揮的作用14
• 5 未來研究方向14
• 6 展望14-15
• 綜述二 沙門氏菌檢測方法研究進(jìn)展15-23
• 1 傳統(tǒng)檢測方法15-16
• 2 免疫學(xué)檢測技術(shù)16-18
• 3 分子生物學(xué)技術(shù)18-20
• 4 沙門氏菌其它檢測方法20-21
• 5 單克隆抗體在沙門氏菌檢測中的應(yīng)用21-22
• 6 小結(jié)22-23
• 參考文獻(xiàn)23-30
• 第一章 沙門氏菌菌毛主要亞單位基因pegA的原核表達(dá)30-43
• 1 材料31-32
• 1.1 菌株及載體31
• 1.2 培養(yǎng)基和主要試劑31
• 1.3 主要儀器設(shè)備31-32
• 2 方法32-37
• 2.1 pegA基因目的片段的擴(kuò)增32
• 2.2 pMD19-T-pegA重組質(zhì)粒的構(gòu)建32-34
• 2.3 pET-22b (+)-pegA重組質(zhì)粒的構(gòu)建34-35
• 2.4 pegA基因的表達(dá)及SDS-PAGE分析35-36
• 2.5 大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白及鑒定36-37
• 2.6 Western blot檢測純化蛋白37
• 3、結(jié)果37-40
• 3.1 PCR擴(kuò)增pegA基因37
• 3.2 重組質(zhì)粒pMD19-T-pegA酶切鑒定37-38
• 3.3 重組質(zhì)粒pET-22b(+)-pegA菌落PCR鑒定38
• 3.4 重組質(zhì)粒pMD19-T-pegA和pET-22b(+)-pegA的測序鑒定結(jié)果38-39
• 3.5 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及分析39-40
• 3.6 PegA蛋白量測定40
• 3.7 Western blot鑒定結(jié)果40
• 4、討論40-42
• 參考文獻(xiàn)42-43
• 第二章 抗沙門氏菌PEG菌毛單克隆抗體的制備43-56
• 1 材料44-45
• 2、方法45-50
• 2.1 抗原的制備45
• 2.2 抗原乳化45
• 2.3 動物免疫45
• 2.4 骨髓瘤細(xì)胞SP2/O制備45
• 2.5 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備45-46
• 2.6 脾淋巴細(xì)胞的制備46
• 2.7 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)46-47
• 2.8 雜交瘤細(xì)胞株篩選47-48
• 2.9 雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇48
• 2.10 腹水的制備及效價(jià)檢測48-49
• 2.11 單抗亞類鑒定49
• 2.12 單克隆抗體特異性檢測49-50
• 3、結(jié)果50-53
• 3.1 免疫小鼠血清效價(jià)檢測結(jié)果50-51
• 3.2 間接ELISA最佳條件確定51
• 3.3 細(xì)胞融合51
• 3.4 腹水純化及濃度測定51-52
• 3.5 腹水抗體效價(jià)52
• 3.6 抗體的亞類鑒定52-53
• 3.7 單克隆抗體穩(wěn)定性53
• 3.8 單克隆抗體特異性檢測53
• 4、討論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-56
• 第三章 抗沙門氏菌PEG菌毛單克隆抗體的初步臨床應(yīng)用56-61
• 1、材料57
• 1.1 菌株和抗體57
• 1.2 主要試劑57
• 1.3 主要儀器設(shè)備57
• 2、方法57-58
• 2.1 凍存菌復(fù)蘇培養(yǎng)57
• 2.2 PegA單抗介導(dǎo)的玻板凝集方法的臨床應(yīng)用57-58
• 2.3 沙門氏菌診斷血清平行對照58
• 3、結(jié)果58-59
• 4、討論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-61
• 全文總結(jié)61-62
• 致謝62-63

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本文編號：747077